爱华网谈DNA分子杂交技术的应用
互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation)当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响:(a) 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。2. 随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
DNA分子杂交过程可简要概括如下：将DNA样品用特定酶降解，用凝胶电泳进行分离，并将DNA浸泡在碱性溶液中使其变性。将变性后的DNA转移到醋酸纤维素膜上，在80℃条件下烤4~6小时，使DNA牢固地吸附在纤维素膜上，让另一段被放射性同位素标记的已知碱基序列的DNA与之进行杂交，然后洗净，除去未杂交的标记物，最后将纤维素膜烘干，进行电镜放射自显影观察，没有标记物的区段就是未交区段，即游离的单链；含标记物的区段就是杂合双链区。目前，DNA分子杂交技术在社会生活中已得到广泛应用。
单链DNA探针
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种1)以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板,用反转录酶合成单链cDNA探针。
1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
应用之一：侦察犯罪或尸体辨认
2004年12月26日印度洋发生海啸，受灾地区除了生存环境受到严重破坏外，同时还面临着大量的尸体辨认问题。这次海啸遇难者达20多万人，事后的尸体辨认就是借助于DNA杂交技术．即从尸体细胞与死者家属提供的死者生前生活用品中分别提取的DNA,然后借助DNA杂交技术对尸体进行辨认。请回答：
(1)人体DNA的主要载体是。
(2)水浴加热能使DNA氢键断裂，皮肤生发层细胞中发生该变化的是过程。
(3)为了确保实验的准确性，需要克隆出较多的DNA样品。若一个只含31p的DNA分子用32P标记的脱氧核苷酸为原料连续复制三次后，含32P的单链占全部单链的。
(4)侦察犯罪的理论基础是：不同个体的DNA分子具有。
(5)下表所示为分别从尸体和死者生前的生活用品中提取的三条相同染色体、同一区段DNA单链的碱基序列，根据碱基配对情况判断，A、B、C三组DNA中不是同一人的是。
A组 | B组 | C组 | |
尸体中的DNA碱基序列 | ACTGACGGTT | GGCTTATCGA | GCAATCGTGC |
家属供的DNA碱基序列 | TGACTGCCAA | CCGAATAGCT | CGGTAAGACG |
(6)为什么尸体细胞与死者家属提供的死者生前生活用品中分别提取的DNA可以完全互补配对。
应用之二；鉴定亲缘关系
用DNA杂交技术同样可以判断不同物种之间亲缘关系的远近，科学家据此得出在所有现存动物当中黑猩猩与人类的亲缘关系最近。试分析这个结论得出的依据：。
三、DNA探针当DNA分子杂交时，首先将DNA双链加热或提高pH，使双链解开(这一过程称变性，相反的过程称复性)，根据所需要的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素或荧光分子标记，即为探针。用这一探针探查基因库中已经变性的DNA片段，如果有一个能和探针片段互补结合而成双链(分子杂交)，这一片段即含有所需的基因。下列有关DNA探针的应用说法正确的是。
A．可应用于环境监测B．可应用于基因诊断
C．可应用于基因治疗D．可应用于培养超级细菌
