酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用 酚氯仿抽提dna

1.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别:

异丙醇和酒精都是有机溶剂,一般来讲,提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀,因为异丙醇沉淀的效果要好一些,但最后大多用酒精沉淀,因为酒精容易挥发,对下游的实验影响小。

异丙醇比较疏水,能很更好地沉淀核酸,用乙醇的目的是去盐,它比异丙醇更亲水,所以能去掉一些盐离子。 有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。

在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2倍体积乙醇沉淀,

但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。

异丙醇:

优点为所需容积小且速度快,适用于浓度低,而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA;但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀,一般不需要在低温条件下长时间放置。

缺点:易使盐类(如NaCl、蔗糖)与DNA共沉淀;在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去,所以常规需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次。

乙醇:

沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂,对盐类沉淀少,DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处,不影响以后的实验。在适当的盐浓度下,2倍样品容积的95%乙醇可有效沉淀DNA,对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍

缺点是总体积较大。需在-20放置很长时间,30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤。

2.一般用的是酚:氯仿:异丙醇为25:24:1(v/v),其中酚是强烈的蛋白质变性剂,能有效使蛋白质变性而除去,氯仿有强烈的脂溶性,去除脂类杂质,本身酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的主要作用是抽提蛋白质

步骤:

质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次,重复此步骤,加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀,零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min,沉淀用75%乙醇洗涤一次,12000 r/min离心5 min,弃上清,沉淀自然干燥后溶于20~40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。

3 用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?

使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。

使用酚的优点:1. 有效变性蛋白质;2. 抑制了DNase的降解作用。

缺点:1. 能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用?

氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中)

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?

异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

为什么用无水乙醇沉淀DNA? 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?

酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用 酚氯仿抽提dna
用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。

  

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