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液体除菌过滤器和除菌过滤工艺的验证
叶 璇 罗姣 胡 明
（派克汉尼汾流体传动产品（上海）有限公司，上海 201206）
收稿日期 ：2012-03-09
作者简介 ：叶璇（1985－），女，工程师，主要从事药物研发工作。
Tel：18616839320 E-mail：emma.ye@parker.com
摘要
通过分析目前新版 GMP 对液体除菌过滤的相关规定，将液体除菌过滤器和除菌过滤工艺的验证分别进行详细的陈述和说明。旨在通过介绍，使大家更进一步了解有关验证的各项内容和目的。
关键词 新版 GMP；液体除菌过滤器；除菌过滤工艺验证
新版 GMP 与 1998 版 GMP 相比，对于液体除菌过滤器和除菌过滤工艺的规定更加严格和具体。新版 GMP 附录 1 第四十一条指出“过滤器应当尽可能不脱落纤维。严禁使用含石棉的过滤器。过滤器不得因与产品发生反应、释放物质或吸附作用而对产品质量造成不利影响。”第六十二条“可采用湿热、干热、离子辐射、环氧乙烷或过滤除菌的方式进行灭菌。每一种灭菌方式都有其特定的使用范围，灭菌工艺必须与注册批准的要求相一致，且应当经过验证。”第六十三条“任何灭菌工艺在投入使用前，必须采用物理检测手段和生物指示剂，验证其对产品或物品的适用性及所有部位达到了灭菌效果。”第七十五条（四）“过滤除菌工艺应当经过验证，验证中应当确定过滤一定量药液所需时间及过滤器二侧的压力。任何明显偏离正常时间或压力的情况应当有记录并进行调查，调查结果应当归入批记录。”第七十五条（五）“同一规格和型号的除菌过滤器使用时限应当经过验证，一般不得超过一个工作日。”
为保证整个生产工艺可控，生产的连续稳定性和生产批次重复性好，工艺验证不仅成为众多制药企业关注的内容，同时也是GMP 等法规实施中的重要部分。FDA 无菌工艺指南（Aseptic Processing Guidelines）中提到， 与过滤器完整性相关的性能测试应包括：模拟生产条件，在最苛刻生产环境下进行微生物挑战试验。美国 GMP 21 CFR Parts210&211 中也指出，必须建立和跟进相应的证明性文件，这些文件中包括所有的除菌工艺的验证文件。
1 工艺验证评估
大多数制药企业在进行工艺验证时，往往会发生过验证的情况，也即有些验证项目并不是 GMP 所规定的内容。因此，在决定是否进行工艺验证之前，首先要对整个生产工艺进行分析评估，将过验证的现象降至最低。下文主要针对无菌和非无菌过滤工艺的验证评估作举例说明。
1.1 工艺验证要求
如表 1 和表 2 所示[1]，总结了生物制药行业无菌和非无菌操作的不同验证要求。特别针对于注射用水WFI 储罐呼吸器和最终灌装过滤器的验证要求。
1.2 法规要求
同样对于无菌和非无菌过滤，所依照的法规指南也是有区别的。虽然对于非无菌过滤所涉及的法规相对较少，但仍需要严格按照法规指南的要求来指导实际生产。如表3 所示，介绍了无菌和非无菌过滤方面所涉及的法规及相关指南。
2 液体除菌过滤器和除菌过滤工艺验证
下文主要针对液体除菌过滤验证做详细介绍。液体除菌过滤的验证通常包括两个方面，一方面为液体除菌过滤器的验证；另一方面为液体除菌过滤
工艺的验证。
2.1 液体除菌过滤器的验证
液体除菌过滤器的验证是指过滤器生产者在将某型号过滤器研制完成后，并投入商业化销售之前，对该型号过滤器所做的一系列测试和验证工作，来充分证明该过滤器的性能。主要内容包括：过滤器各组件的材质；通过一系列测试得到过滤器的最大操作参数，如：灭菌寿命、耐受温度和压力、化学兼容性等；采用水和有机溶剂进行释出物和生物安全性测试；通过实验建立细菌挑战测试和完整性测试的关联数据等。
对于大多数过滤器生产商来说，过滤器本身的验证工作一般都以文本的形式体现出来—即验证指南。制药企业在进行过滤器选型和审批时可以要求供应商提供该型号过滤器的验证文本。
2.2 除菌过滤工艺的验证
按照 PDA 技术报告 26 号（2008 年修订版）[2]液体除菌过滤的要求，整个过滤工艺的验证分为八个步骤，包括：过滤器选型；验证方案的确定；挑战微生物活力测试；产品的完整性测试参数的确定；过滤工艺模拟和兼容性测试；细菌截留实验；析出物分析；出具最终验证文件。主要针对但不局限于细胞培养基、缓冲液、间接的无菌工艺和终端无菌过滤工艺的验证。
2.2.1 过滤器选型
在做过滤工艺验证之前，我们首先要确定其所针对的过滤器型号是什么。如果制药企业的客户对即将投入使用的过滤器型号未知或不确定，那过滤器生产商可以提供相应的过滤器选型服务，通过一系列膜片小试，以及囊式过滤器的中试放大实验，来帮助客户确定适用于其生产工艺的最佳过滤器型号。
2.2.2 验证方案的确定
确定验证方案之前，过滤器生产商一般会给到客户一份验证调查表，其中涵盖了客户需要验证的工艺信息，如：流量、压力、在线灭菌温度和次数等。客户按照其生产工艺的实际情况填写，并反馈给过滤器生产商。过滤器生产商根据客户提供的各项工艺参数信息，制定相应的验证方案。
2.2.3 挑战微生物活力测试
根据 ASTM F838-05 的要求，通常采用浓度大于 107/cm2有效过滤面积(EFA) 的假单胞菌溶液来定义除菌级别过滤器。因此，通过模拟过滤器的预期使用时间，来确定标准挑战微生物与客户料液接触相同时间后的活力，这一步是非常重要的。
当该微生物没有活力时，需要选用其他微生物或选择替代溶液，来完成后续的细菌挑战实验。
2.2.4 产品的完整性测试参数的确定
制药企业在实际生产过程中，为缩短生产工艺，提高生产效率，在对液体除菌过滤器进行完整性检测时，往往希望直接采用过滤料液作为润湿液体来进行检测。而不是常规的水溶液或其它有机溶剂。由于客户的料液产品与常规润湿液相比，它的表面张力以及对测试气体的扩散性质等不同，所以，我们需要通过测试来建立两者之间的关联性，如图1所示，从而得到产品作为润湿液的完整性测试参数。
2.2.5 过滤工艺模拟和兼容性测试
在对过滤器进行细菌挑战实验之前，首先要对测试滤芯进行工艺模拟。工艺模拟采用的参数条件，需保证与客户在验证调差问卷中填写的参数一致。包括：实际的处理体积；流量；温度；在线灭菌温度、时间和次数等。通过小规模到全规模的工艺模拟来对过滤器进行真实、精确的评估，使您对过滤器的实际性能有充分了解。
2.2.6 细菌截留实验
细菌截留实验以产品或替代溶液（若细菌在产品中无活力）作为实验液体，考察滤芯截留性能的表现。
一方面，实验溶液可能在渗透压、pH 值和抑菌方面对实验细菌的尺寸造成影响。另一方面，滤芯的性能也会受过滤时间、CIP、SIP、过滤批次大小和流量的影响。
一 般选用假单胞菌 Brevundimonas diminuta（ATCC19146）作为挑战菌，将其溶于测试料液中使其浓度达107/cm2EFA（有效过滤面积）以上，即保证LRV 值大于 7（LRV=Log10(上游挑战菌数量/ 滤出液挑战菌数量 )。具体的细菌截留实验装置如上图2 所示。将装有挑战菌的储罐中通入压缩空气，测试菌液会依次通过测试过滤器及下游的测试膜片，整个过程大概维持30min。实验完成后，取出下游测试膜片并进行培养，观察其是否有菌落生成。若测试膜片上发现有菌落长出，说明前处理工艺可能对滤膜造成影响，需要调整现有的生产工艺。
2.2.7 析出物分析
注射剂管理委员会第 15 号及 26 号报告中描述了过滤器析出物评估方法。了解析出物水平有利于：决定过滤器预先冲洗的体积；决定过滤器能否用于小体积过滤（无法冲淡和稀释析出物）；是否能够直接灌装（这时第一瓶的析出物含量最高）。
析出物的检测可以通过傅里叶红外光谱 ATR-FTIR、反向高效液相色谱RP-HPLC、液质联用LC-MS、气质联用GC-MS 等先进设备和技术完成。
取滤前和滤后的样品，分别做红外光谱扫描。由于料液中的不同成分具有特定的吸收波长，通过分析该特定波长，从而判断样品中成分的差别。图3 所示红外光谱的作用原理图。
对滤前和滤后样品检测得到的红外谱图进行比对，其相关因子小于 0.980 0 则说明过滤器的析出物水平在规定范围之内。表 4 所示为某产品滤前三次红外测试谱图（UNFILTERED1, 2, 3）和经三支不同批次滤芯（LOT.NO. 1104221, 1104222,1104223）过滤后的红外谱图的相似度比较，其相关因子都在0.980 0以上，说明过滤器对于该产品的析出物水平符合要求。
2.2.8 出具最终验证文件
通常最终的验证文件包括前期过滤器生产商提供的，并由客户签字确认的验证方案和后续的验证实验报告。
3 其他
综上所述，整个过滤工艺验证包括八个步骤。当然，制药企业也可以根据其实际情况，选择其中的几项来进行工艺验证工作。
需要注意的是，过滤工艺验证不是一次性的工作，首次验证后还应根据产品质量和风险评估情况进行再验证。如果在以后的生产过程中，发生工艺参数的改变，如：提高流量和过滤批次、pH 值以及工作温度的变化等，都需要进行再验证，以确保其生产条件始终能够达到预期效果。
参考文献：
[1] Mills, G. J. & B. Bardo. BioProcessInternational[J]. May 2006,30-38.
[2] PDA Technical Report 26, Liquid SterilizingFiltration, Parenteral.
