爱华网狂犬疫苗简介
一、市场上的狂犬疫苗技术、产品和生产厂家
1、纯化地鼠肾细胞狂犬疫苗（purified hamster kidney cell vaccine, PHKCV）
有前苏联研制成功，1967年以后，开始用Vnukova-32毒株感染原代地鼠肾细胞生产。并在中国推广使用。
缺点：疫苗的效价偏低（小于2.5IU/剂量），液体稳定性差。1993年卫生部要求对原制疫苗进行浓缩，要求效价达到WHO规定的≥2.5IU/剂量标准。结果疫苗效价虽然有提高，但是细胞碎片和非蛋白及小牛血清等非特异性物质也相应增加，致使这种疫苗不良反应增加，使得疫苗完成全程注射受影响。
毒种：
aG株，来源于“北京株”，通过兔脑传代30代，演变成固定毒，31带后用于疫苗生产。北京株经适应PHKC达55代称为a株；为了进一步提高滴度，有经豚鼠脑内和PHKC交替传代，选育出“aG株固定毒”（aGfixed virus Strain）。
2、人体二倍体细胞狂犬疫苗（human diploid cell rabies, HDCV）
人体二倍体细胞是指正常人体组织在体外培养的细胞。细胞株来源于正常人胚胎或者其他组织的细胞群体，其染色体数目与原供体细胞染色体数目相同，无异种移植致癌性，无外源因子污染，在正常情况下具有有限生命期，故属有限生命细胞株（finitecell strain）。对病毒敏感谱广，主要用于培养病毒和制备病毒类疫苗。
自1960年以来，开始建立人体二倍体细胞株，其中有2株为国际公认为人体二倍体细胞参考株：
1）、WI-38株，是1961年美国Wistar研究所用人工流产的一个3月龄女性胎儿的肺组织建立的，有限生命为48代。WI-38细胞株曾广泛用于病毒研究和疫苗生产。但在1975年，美国标准菌种收藏中心（ATCC）发现该细胞株早期（8代）已被污染。
2）、MRC-5株，是英国于1966年由一个14周龄的人工流产男性胎儿的肺组织建立的，有限生命为48代。经鉴定，认为该细胞株可用于疫苗生产，将MRC-5代替WI-38作为国际参考株。
3）其他人体二倍体细胞株，
KMB-17株是1973年中国用一个流产的4月龄女性胎儿肺组织建立的，有限生命为67代。
2BS细胞株是1973年中国由一个流产的3月龄女性胎儿肺组织建立的，有限生命为63-65代。
KMB-17和2BS细胞株，在中国已用于脊髓灰质炎活疫苗、甲型肝炎活疫苗的生产。
上世纪70年代，中国将狂犬病毒固定毒株（CTN）感染KMB-17株人体二倍体细胞，经反复传代，获得狂犬病毒HDC（humandiploid cell）适应株（CTN-1），在KMB-17细胞内增殖，病毒滴度可达6.5～7.0lgLD50/ml。经WHO鉴定认可作为疫苗生产毒株。
1990年，又将CTN-1株适应Vero细胞，病毒滴度可达8.0 lg LD50/ml，现已用于PVRV（purifiedvero cell rabies vaccine）试生产。
国外狂犬疫苗产品用人体二倍体细胞生产的产品有：
IMOVAX
为欧洲的赛诺菲-巴斯特（Sanofi Pasteur）的产品，毒株为PM-1503-3M，细胞株为MRC-5。
3、纯化Vero细胞狂犬疫苗
1981年，WHO批准使用传代细胞（CCL）生产灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。1987年，WHO颁布了使用传代细胞生产人用狂犬病毒疫苗规程。
使用传代细胞生产狂犬疫苗的优点在于：细胞来源有保证，省去使用动物制备细胞。传代细胞比原代细胞更一致、更洁净。无外源因子污染、无致癌活性。适于微载体培养，病毒产量高。比人体二倍体细胞疫苗可降低成本4～6倍。
目前，我国已相继建立了4株Vero细胞适应固定毒：
1）、豚鼠脑aG株Vero细胞适应株（RFD）；
2）、小鼠脑CTN株Vero细胞适应株（CTN-V）；
3）、人体二倍体细胞CTN-1株Vero细胞适应株（CTN-1-V）；
4）、兔脑北京株Vero细胞适应株；
以上几个适应株产病毒滴度均已达到WHO规定生产PVRV的要求。
4、纯化鸡胚细胞狂犬疫苗（purified chicken embryonic cell vaccine, PCECV）
日本自20世纪60年代开始研制PCECV，1980年正式投产。
德国采用Flury-LEP狂犬疫苗毒种，适应SPF原代鸡胚细胞（CEC），并用以制备疫苗
二、Vero细胞介绍
Vero细胞的正式名称为“非洲绿猴肾细胞”，是传代细胞的一种。所谓传代细胞可简单的理解为，在体外可以连续传代的细胞系，理论上具有无限传代的寿命。传代细胞系可以通过以下方法衍生而来，（1）正常细胞群的连续传代，繁衍成一个新的具有无限寿命的细胞群，例如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞；（2）人或动物肿瘤细胞的原代细胞的系列培养，例如Hela细胞、Namalva细胞等；（3）携带致癌基因的病毒，将致癌基因转化给正常细胞，成为肿瘤细胞，例如EB病毒转化的B淋巴细胞；（4）骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，例如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
由于肿瘤细胞或携带肿瘤基因的细胞具有致肿瘤的危险，所以该类细胞不能作为细胞基质用于疫苗生产；因此用于疫苗生产的细胞系均采用非肿瘤细胞系，即正常细胞群的连续传代后繁衍的细胞系，在一定传代限度内使用，目前使用的Vero细胞属于此类。Vero细胞由于具有传代细胞特性，因此也存在理论上的潜在致肿瘤性。目前WHO认为130～150代细胞无致肿瘤性，可以用于疫苗的生产。目前国内研制的Vero细胞基质的疫苗，细胞致肿瘤试验均为阴性，已批准上市多年的产品，未见有安全性方面的问题。有报导超过170代的Vero细胞致肿瘤试验阳性。
由于传代细胞调控生长的基因失调，使得传代细胞系具有无限的寿命。因此，理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在能力，因此需对疫苗的Vero细胞残余DNA进行质量控制。传代细胞可分泌生长因子（称促生长蛋白），该生长因子可以促进细胞生长，在异常情况下有致肿瘤作用，并需要持续作用。鉴于目前国际上尚无特异性Vero细胞蛋白的检测手段，现仍以疫苗蛋白总量进行间接质控。
综上所述，Vero细胞生产疫苗具有理论上的潜在致肿瘤性风险，控制该风险的措施有两个方面，其一为控制Vero细胞的代次在130～150代，其二为降低Vero细胞残余DNA含量、残余蛋白含量（通过总蛋白含量进行间接质控）。目前国际上及国外公司对Vero细胞残余DNA含量、总蛋白含量的控制标准如下表：
关于Vero细胞DNA残余量，国际上控制标准有所不同：
（1）WHO的标准比较宽松，无论是否用于婴幼儿的，均控制在≤10ng/剂量；
（2）欧盟相对于WHO，提高了婴幼儿使用疫苗的要求，婴幼儿疫苗≤100pg/剂量，非婴幼儿疫苗≤10ng/剂量；
（3）已知的两国外公司对婴幼儿疫苗更提高了要求，控制在≤10pg/剂量。
一家订入规程，一家作为内控标准。
（4）我国上市的狂犬病疫苗≤100pg/剂量，相当于欧盟的婴幼儿使用疫苗的要求。
（5）我国上市的乙型脑炎纯化疫苗（04年上市）使用人群包括婴幼儿，控制在≤10ng/剂量,符合WHO通则、欧盟通则、WHO对婴幼儿疫苗的要求，达不到欧盟对婴幼儿疫苗的要求（≤100pg/剂量），更达不到外企的控制标准（≤10pg/剂量）。
（6）肾综合征出血热纯化疫苗（02年上市）使用人群为成人，控制在≤10ng/剂量, 符合WHO通则、欧盟通则要求。
关于总蛋白含量，因疫苗（病毒蛋白）的免疫原性不同，每种疫苗不尽相同，国际上对IPV要求为≤10ug/剂量；我国要求狂犬病疫苗≤120ug/剂量；据调研，乙型脑炎的剂量≤10ug蛋白具有较好的免疫原性。在此需指出，无论是WHO、欧盟还是中国药典的要求，均为最低要求，企业需在满足上述相关要求的基础上提高要求并拟定注册标准。
对于我国企业采用Vero细胞生产疫苗，需按照注册申请的拟定注册标准（参见2004年3月12日刊登在CDE网站的《关于对预防用生物制品注册标准的理解和拟定原则的考虑》），其中包括Vero细胞DNA残余量及总蛋白残余量，建议在拟定注册标准时作如下考虑：
1.加强去除细胞DNA和去除杂蛋白（细胞蛋白）的工艺研究，最大限度的降低DNA残余量和总蛋白含量。尤其是用于婴幼儿的疫苗（如IPV、乙型脑炎疫苗等），最好能控制在DNA残余量≤10pg/剂量，总蛋白含量≤10ug/剂量。
2.对于达不到DNA残余量≤10pg/剂量，总蛋白含量≤10ug/剂量的产品，不建议在2岁以下婴幼儿人群中使用。
Vero细胞残余DNA、残余蛋白（包括促生长蛋白）可能对人体有潜在的致肿瘤性及其他危害，建议疫苗生产研究单位研究特异性检测Vero细胞蛋白的方法，为今后制定相关质量控制标准奠定基础。此外，目前阶段应尽量降低疫苗总蛋白含量，间接控制细胞残留蛋白。关于Vero细胞残余DNA危害，除了与残余DNA含量的多少有关外，还与残余DNA片断的大小有关，残余DNA含量越高、片断越大，其潜在的致肿瘤性越大。因此，建议疫苗生产研究单位强化纯化工艺，尽量降低残余DNA含量；此外，研究并建立检测Vero细胞残余DNA片断大小的方法，为今后制定相关质量控制标准奠定基础。
三、细胞基质
大多数现行疫苗是通过组织培养的方法制备的，所谓组织培养是体外培养一定量的动物细胞并接种病毒，利用病毒在细胞内增殖，得到预期的病毒抗原，然后制成疫苗。
众所周知，疫苗的质量控制是全面的质量控制，包括原材料、生产过程、半成品、成品，细胞基质是疫苗生产的主要原材料，其质量控制直接影响终产品的安全性。本文简要介绍WHO对细胞基质质量控制的要求。
1. 细胞基质的种类
-1.原代细胞：动物组织经胰酶消化培养成单层细胞，用于病毒的培养。如地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞等。在疫苗的生产中使用了40多年，证明是安全有效的。
优点：1）相对简单；2）具有广泛的敏感性。
缺点：1）有较严重的潜在的病毒污染问题，动物的级别很难达到SPF级；2）来自不同动物的质量和敏感性有差异；3）动物来源越来越困难，尤其是灵长目动物。
-2.二倍体细胞：具有一定的传代寿命，超过一定代次，细胞衰老。如2BS细胞、MRC-5细胞等。在疫苗的生产中使用了30多年，证明是安全有效的。
优点：1）能够充分鉴定和标准化；2）使用种子库系统生产。
缺点：1）不易大规模生产，尤其是不能微载体生物反应器。2）对培养基及牛血清的要求较高。
-3.传代细胞：理论上具有无限传代的寿命。如Vero细胞、BHK21细胞等。
优点：1）能够充分鉴定和标准化；2）使用种子库系统生产。
3）可大规模生产，可用于微载体生物反应器。4）对培养基及牛血清的要求不高。
缺点：理论上有致肿瘤性的危险。但已证明Vero细胞在134~150范围内使用，无致肿瘤性。
2. 动物细胞的潜在危险
-1.病毒污染：
1）人类或灵长目动物细胞可能携带潜在病毒，如乙型肝炎病毒、逆转录病毒等。
2）禽类组织细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，
3）啮齿类细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，
-2.细胞DNA
l原代细胞和二倍体细胞的残余DNA无危险性。
l传代细胞系的DNA具有是其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在能力。并认为＜10ng/剂量是安全的。
-3.促生长蛋白
生产细胞可分泌生长因子，认为不构成严重危险。但使用传代细胞生产的疫苗，应进行纯化，去除细胞蛋白。
3.WHO的有关要求
（一）对所有生产细胞的要求
-1.GMP
1）规范的操作；
2）原材料的选择，细胞的供体应无传染病或病因不能确定的疾病。
-2.细胞培养中的有关检测
1）牛血清：无细菌、真菌、支原体和感染性病毒。有些国家还要进行无噬菌体的检测；有些国家使用辐射的方法灭活潜在污染的病毒。用TSE非疫区的牛血清。
2）胰酶：无细菌、真菌、支原体和感染性病毒，特别进行牛或猪细小病毒的检测；有些国家使用辐射的方法灭活潜在污染的病毒。
3）生产结束时的检测：无细菌、真菌、支原体。
4）生产结束时检测外源性病毒。
（1）25%的对照细胞（不接种病毒）无病变；（2）豚鼠红细胞血吸附法检测阴性；（3）转种人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系无病变并血吸附阴性。
（二）对传代细胞的要求
-1.建立主代细胞库、工作细胞库
对于主代细胞库须进行一次全面的外源因子检定，检测可能存在的内源性和外源性外源因子，特别注意已知以潜伏状态存在于来源物种中的因子。主代种子库检定合格后，工作种子库和生产细胞只进行一般的外源因子检查。
l无菌试验（细菌、霉菌、支原体）
l细胞法检测病毒外源因子：至少用107细胞转种人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系，无病变并血吸附阴性。
l用动物和鸡蛋检测病毒因子：
1）乳鼠2窝（每窝至少10只），脑内、腹腔注射。
2）成鼠10只，15~20克，脑内、腹腔注射。
3）豚鼠5只，350~450克，腹腔注射
4）家兔5只，1.5~2.5kg，皮下注射
5）鸡胚10只，9~11日龄，尿腔囊。
6）鸡胚10只，5~6日龄，卵黄囊。
以上每组接种待检细胞数量不少于107个，动物观察至少4周，鸡胚至少观察5天，应键存。
l逆转录病毒的检测：一般用高敏感性的细胞扩增待检细胞培养物中的逆转录病毒，然后进行检测。
1）感染性检测
2）透射电镜检测
3）逆转录酶分析
l致肿瘤性检测
动物：1）裸鼠；2）新生小鼠或大鼠经抗胸腺血清处理；3）无胸腺小鼠。
每只动物皮下注射107细胞，以Hela细胞（106）作阳性对照，有结节的观察1~2周，解剖做病理检查。无结节的，一半观察21天，另一半观察12周，解剖做病理检
查，应为阴性。
3. 二倍体细胞
除要传代细胞的检测项目外，增加细胞染色体分析。
检测200个分裂中期的细胞，计算染色体数目，检测超二倍体、亚二倍体、多倍体、断裂和结构异常的比例。
4、小结
细胞基质在疫苗生产中必不可少，其质量的优劣可直接影响疫苗的质量。细胞基质无外源因子污染，是保证疫苗具有安全性的重要因素之一。对于已使用多年并被实践证明是安全的细胞系，可通过细胞种子库及检定进行质量控制；对于一个新的细胞系，应进行全面的系统的鉴定和检定，确保其不含有内源性和外源性的污染。
