爱华网您是第 892位读者发布时间: 2009-6-15 9:33:40
关键词：低密度脂蛋白
来源： CHKD期刊全文库《临床检验杂志》2009年第2期
（本文作者：南京军区南京总医院 杨锦涛等）
氧化低密度脂蛋白(Ox－LDL)是沉积在血管壁上的血浆低密度脂蛋白(LDL) ,由内皮细胞、平滑肌细胞和单核－巨噬细胞三类动脉壁细胞在过量自由基及其他致氧因素作用下,使LDL 中的多价不饱和脂肪酸发生过氧化产生多种活性醛类,如丙二醛(MDA ) 和壬烯醛(HNE) 等, 与载脂蛋白B( apoB)中赖氨酸残基结合发生化学修饰而形成的产物。Ox－LDL不但能促进泡沫细胞的形成, 而且具有细胞毒性作用,是动脉粥样硬化(As) 、心血管疾病发生发展的重要因素。本文就其生物学功能与临床意义以及检测方法做一综述。
1 Ox－LDL的生物学功能及临床意义
在多种疾病中Ox2LDL会升高,如冠状动脉疾病、颈动脉粥样硬化、移植伴随的动脉硬化、接受血液透析的病人以及糖尿病等。动脉粥样硬化病变的Ox2LDL 定量分析显示,在损伤部位有大量的Ox-LDL蓄积。在一种疾病的不同阶段Ox-LDL的水平也会改变,在急性心肌梗死、脑梗死、经皮冠状动脉腔内成形术的急性期Ox-LDL水平会升高。对这些病人住院期间和出院后测定Ox-LDL水平的跟踪调查发现,Ox-LDL峰值出现在急性期(疾病发生后的1到3d内) ,然后会逐渐降低至接近正常水平,原因推测是在梗死发生时Ox-LDL可能从破裂的斑块中释放入血。
氧化低密度脂蛋白目前被认为是促进As的危险因素,其与As的关系主要有:与正常LDL 主要是通过肝脏的LDL 受体分解代谢的途径不同。Ox-LDL 主要通过单核－巨噬细胞、血管内皮细胞的清道夫受体的识别和摄取,以正常LDL的数倍至10倍的速度进入细胞,导致细胞内胆固醇酯的蓄积,促使巨噬细胞形成泡沫细胞,而泡沫细胞的出现是As病变的早期变化和特征标志。Ox-LDL 具有很强的细胞毒性,可以抑制内皮舒张因子(EDRF) ,引起内皮功能障碍,促使单核细胞及LDL 进入血管内膜下,加速脂质条纹的形成。此外,Ox-LDL能直接或间接使一氧化氮(NO)灭活,而NO作为内皮细胞合成的舒张因子,目前认为是维持冠状动脉舒张的关键物质,能抑制LDL 氧化。Ox-LDL 能改变局部前列腺素的平衡,促使局部血小板聚集能力增强及微循环障碍。Ox-LDL有很强的免疫原性,可刺激机体产生自身抗体并在硬化斑块中与抗体结合,形成可被吞噬细胞的Fc受体快速摄取的低密度脂蛋白循环免疫复合物(Ox-LDL－IC) ,Ox－LDL－IC引起巨噬细胞内胆固醇酯的堆积,并转化为泡沫细胞,且作用比Ox-LDL更强。还有研究认为, Ox-LDL 可破坏血管内皮细胞的骨架结构,从而导致血管内皮细胞的屏障功能的损害,这一作用也可能与As形成有关。测定Ox－LDL水平对预测心血管疾病的发生也有指导意义。Naruko小组跟踪调查102例因急性心肌梗死入院并治愈出院的患者,发现其中6个月内发生再狭窄患者的Ox-LDL水平要明显高于未发生再狭窄的患者。据此可以推测,平常状态时高水平的Ox-LDL可能代表体内有强的氧化应激反应。
2 Ox-LDL的EL ISA检测方法
血浆中Ox-LDL含量很低,常规生化分析方法难以直接检测。目前最常用的检测方法是EL ISA法,是公认的特异性较好的Ox-LDL检测方法。测定中使用的特异性抗体有多克隆和单克隆抗体,单抗仅针对单一检测位点,而多抗可同时识别多种氧化位点。由于不同抗体测定的位点不同,以及使用的参考品不一,导致不同方法学之间测定结果不一致,缺乏可比性。具体检测何种位点更具有临床价值也是有待研究和解决的问题。
目前国外用于测定循环Ox-LDL水平的单克隆抗体主要有3种:DLH3, E06和4E6。DLH3与LDL、乙酰化LDL以及糖化LDL亲和力不强,而与Ox-LDL有强的亲和力。它能识别Ox-LDL中脂质的氧化产物氧化磷酸卵磷脂(Ox－PC) (包括9－CHO－PC) 。该抗体通过用人动脉内壁粥样斑块组织匀浆免疫小鼠制得。E06也能识别Ox－PC,但其识别的抗原决定簇是磷酸卵磷脂( PhoCho) ,即PC的亲水部分,该抗体是由免疫apoE－基因敲除小鼠的B细胞克隆制备的。4E6抗体是用铜诱导的Ox-LDL免疫小鼠得到的,该单克隆抗体与Ox-LDL的亲和力比与LDL的亲和力强约1 000倍。EL ISA方法检测人血浆中的Ox-LDL含量既可以采用双抗体夹心法,也可以采用竞争法。
2. 1 双抗体夹心法 双抗体夹心法是抗原被捕捉在两个抗体之间的EL ISA 方法。Itabe等建立的夹心酶联免疫分析法使用抗氧化磷酸卵磷脂(Ox－PC)单克隆抗体DLH3和抗人apoB多克隆抗体,检测的抗原是被Ox－PC氧化修饰的含apoB 颗粒。检测前要将每个待测血浆样本的LDL成分分离出来,检测结果以“ng Ox-LDL /μg LDL 蛋白”表示。该结果并不直接代表血浆中的Ox-LDL 浓度,而是反映氧化的LDL颗粒在血浆总LDL成分中所占的比例。这种方法的局限性在于它不适用于群体筛查。离心分离血浆中LDL需要数小时,并且一次只能同步处理8～10个样本。分离出的LDL成分还需要较长时间透析以除去KBr,测定8～10份样本至少需要3 d时间才能完成。KyowaMedex公司(Tokyo, Japan) 建立了另外一种使用DLH3夹心EL ISA 检测法。该公司研制了一种血浆Ox－LDL EL ISA测定试剂盒(MX) ,并投入商品化生产。为了适应大批量样本测定,该试剂盒使用预包被EL ISA板,测定稀释血浆中的Ox－LDL水平,整个流程可以在1 d内完成。LDL在冷冻和融化的过程中会发生聚集,聚集的LDL 会增强抗apoB抗体的多价反应从而增加EL ISA的呈色,会干扰通过氧化修饰途径而产生的呈色,从而使检测结果产生误差。为解决这个问题,该试剂盒提供了一种抗冻剂用于样本的保存,使得血浆样本可以在- 20 ℃保存数月。
以上两种测定法虽然都是使用DLH3单克隆抗体,但是两种方法测得的数据却不可以直接比较。首先, Itabe的方法测定的是LDL颗粒中Ox－LDL的比例。而MX试剂盒测定的是血浆中Ox－LDL的浓度。造成这种结果的原因在于这两种方法的样本制备方法不同,前者用的是分离的LDL,后者使用稀释的血浆。其次,两种测定法所用的Ox－LDL标准是在不同的条件下制定的。因此,用其中一种测定法测得的Ox－LDL单位并不等同于用另一种测定法测得的结果。
为了研究这两种都使用DLH3单克隆抗体的EL ISA测定法所得结果的相关性,临床上分别用这两种方法测定了50例急性心肌梗死(AM I) ,不稳定型心绞痛(UAP)和稳定型心绞痛( SAP)病人血浆的Ox－LDL水平。统计比较两者测得的值显示,两种方法虽有一定相关性(R*2 = 0. 151) ,但是并不能通过某个具体的公式将两种结果直接相互转化。有时这两种测定法会得出相反的结果,比如用MX试剂盒测得Ox-LDL高水平的样本,用Itabe的方法检测却是低值。
研究发现,在对心血管病人的检测中,MX试剂盒测得的Ox-LDL值与LDL2C浓度有相关性(R*2 = 0. 303) ,而Itabe测定法测得的Ox-LDL值与LDL-C浓度无显著相关性。造成这种不同的原因可能是由于LDL成分的分离方法不同,使Ox-LDL测定有了本质上的差异。使用全血浆测定不仅会检测到Ox-LDL,可能还会检测到其他氧化修饰的脂蛋白及其化合物。由于LDL是人血浆中主要的含apoB 的脂蛋白,所以氧化VLDL和氧化乳糜微粒对检测的干扰很小。Lp ( a)是唯一的共价结合大分子apo ( a)的LDL,并且被认为对氧化很敏感。Lp ( a)血浆浓度以及分子量在不同人之间有很大差异,因此很难规定Lp ( a)的大小和密度。有可能Lp ( a)颗粒比正常LDL颗粒密度高,在从血浆分离LDL 时Lp ( a)被清除了,这也许是导致两种测定法结果差异的原因之一。
Penny、Fang等使用抗PhoCho单克隆抗体E06以及化学发光检测器建立了双重EL ISA夹心法(又称“Witztum法”)测定Ox-LDL。此法基于两种单克隆抗体,一种是抗apoB单克隆抗体MB47,另一种是生物素化的抗PhoCho单克隆抗体E06。在这种测定法中,两个EL ISA夹心法测定平行进行,使用的样本均为稀释的血浆样本。在一块反应板中通过抗apoB的单克隆抗体MB47 和生物素化的E06 来测定Ox-LDL,而在另一块反应板中使用MB47和抗apoB 单克隆抗体MB24来测定apoB 的总量。由于MB24 与Ox-LDL 和LDL都能结合,因此后者结果表示了Ox-LDL 和LDL 的总量。两块板测定结果的比值反映Ox-LDL 的氧化修饰率。Witztum测定法与Itabe 测定法的相似之处在于都是测定LDL中氧化产物的比例。Witztum法测得的氧化apoB微粒的平均值约为0. 3摩尔,而Itabe法测得的平均值是0. 1 ng/μg LDL。前者代表每1摩尔LDL中共出现了0. 3摩尔的氧化抗原决定簇,后者则表示10 000个LDL 微粒中有1个发生了氧化。Witztum法测定值包含了修饰度,因此,如果1个LDL微粒上出现了10个磷酸卵磷脂( PhoCho)部分,则计数为10。而Itabe法测定值对氧化修饰程度不同的LDL 微粒所得的计数是一样的。由于有部分LDL颗粒在体内氧化修饰成Ox-LDL的过程中有多个抗原表位参与了反应,即体内Ox-LDL微粒之间的氧化修饰程度不一,因此这两种测定法所得结果存在明显差异。
2.2 竞争法 Holvoet等建立了一种简单的EL ISA竞争法来测定稀释的血浆中Ox2LDL 浓度。稀释后的血浆样本用已知量的4E6单克隆抗体进行预反应,接着转移到包被有Ox-LDL的反应板上。血浆中Ox2LDL量越多,在预反应过程中4E6单克隆抗体消耗的也就越多,通过测定剩余的4E6单克隆抗体即能反映血浆Ox-LDL的浓度。目前,基于Holvoet测定法的试剂盒已经投入商业化生产。
由于LDL是一个包含了一个apoB分子和大量三酰甘油、游离胆固醇、胆固醇酯、磷脂分子的大微粒,因其脂质中的多不饱和脂肪酸易于氧化,因此即便在反应的早期,一旦LDL被氧化,就会形成多种氧化脂质。随后, apoB被一些氧化脂质修饰,使Ox-LDL产生了聚集形式和apoB碎片。因此Ox-LDL是非均质的氧化修饰脂蛋白颗粒,而这些Ox-LDL的单克隆抗体只识别了LDL的一部分而不是针对整个颗粒。因此,可以认为以上4种Ox-LDL的EL ISA测定法均不能测定Ox-LDL的绝对量,但是可以相对反映体内Ox-LDL水平的变化。
3 Ox-LDL的其他检测方法
3. 1 共轭双烯法 共轭双烯法是一种较为广泛使用的反映LDL氧化易感性的检测方法。该方法分离血浆中LDL后,在体外用氧化剂(常用Cu2 + )诱导,使脂蛋白内多聚不饱和脂肪酸被氧化形成共轭双烯(CD) 。CD在234 nm有最大吸收峰,每隔5 min于波长234 nm测吸光度值,根据LDL氧化产生的CD量随时间变化绘制氧化曲线(图1) , 该曲线可分为三个阶段:延滞阶段,以延滞时间(min)表示,反映LDL抗氧化能力的大小;增殖阶段,以该段曲线斜率表示CD生成率( nmol CD /mg LDL ·min-1 ) ; 降解阶段,以生成的总CD 值( nmol CD /mg LDL)表示,反映LDL氧化程度。由于该方法是在体外用氧化剂诱导氧化过程,并不能完全表达循环中天然存在的Ox-LDL状态,但通过共轭双烯法检测可以探测循环中LDL的氧化易感性,对了解LDL的氧化过程和防治心脑血管疾病有参考价值。
3. 2 硫代巴比妥酸反应物( TBARS)化学测定法 硫代巴比妥酸测定法是基于化学原理测定Ox-LDL的方法。方法根据脂质过氧化过程中产生可与硫代巴比妥酸反应、生成在532nm处有最大吸收峰的硫代巴比妥酸反应物( TBARS)而建立。反应物经离心、正丁醇提取后测定532 nm波长处吸光度值,通过与以1, 1, 3, 32四乙氧基丙烷配制的标准溶液所测得的吸光度值相比,相对定量反映Ox-LDL 的浓度。该方法操作简便、花费少、重复性好, 不仅可以用于人血Ox-LDL的测定,同时也可以用于动物实验,因此被广泛用于脂质过氧化程度的评价。方法的不足在于血清中共存的糖和氨基酸也会发生与硫代巴比妥酸反应而对测定结果有干扰,因此特异性较差。
3. 3 相对电泳迁移率法 相对电泳迁移率法的原理是在脂质过氧化反应中,LDL上的卵磷脂在卵磷脂酶的作用下生成溶血卵磷脂和多聚不饱和脂肪酸,后者在氧自由基的作用下被氧化产生丙二醛、42羟基222壬烯醛等脂质过氧化物,同时发生磷脂水解、apoB降解等反应使LDL 结构发生变化,生成的醛类物质与apoB中一些游离氨基如赖氨酸残基结合导致其负电荷增加, 表现在琼脂糖凝胶电泳时电泳迁移率加快。在pH 8. 6的巴比妥缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳,以天然未修饰的LDL作为基准对照(REM: 110) ,Ox-LDL与LDL的实际迁移距离之比即为Ox-LDL 的相对电泳迁移率(REM) 。REM的增加程度可作为Ox-LDL分析指标。该法常联合硫代巴比妥酸反应物化学测定法共同反映LDL的氧化修饰程度,以评价各种药物对LDL氧化修饰过程的影响。
3. 4 抗Ox-LDL自身抗体测定方法 LDL主要在血管内皮下发生氧化修饰,由于血浆中抗氧化物质较多,使Ox-LDL存在时间很短且量少,加之直接测定血浆Ox-LDL会受到体外氧化修饰的影响。因此,检测血浆中的Ox-LDL 往往并不能代表血管内皮下致动脉粥样硬化作用的Ox-LDL水平。研究发现在人动脉粥样硬化病变中Ox-LDL存在抗原决定簇,检测血清抗Ox-LDL自身抗体滴度,不仅可以预测动脉粥样硬化冠心病,而且可以作为粥样硬化斑块的标志物,反映体内LDL的氧化修饰情况。目前大多数检测Ox-LDL 自身抗体的方法都是以固相免疫分析为基础, 采用酶联免疫吸附实验( EL ISA) 或放射免疫分析法(R IA)检测,主要检测IgG类和IgM类抗Ox-LDL抗体水平。初步实验显示,提取的Ox-LDL自身抗体可作为包被抗体,结合酶标记的抗apoB用于检测体内Ox-LDL,也可与Ox-LDL结合制备人源的LDL2IC用于相关研究。
4 总结
氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)近年来被认为是动脉粥样硬化发生发展的关键步骤,它在多种疾病过程中都有异常,对心血管疾病的诊断、预警及治疗效果的判断有重要意义。鉴于机体内Ox-LDL水平极低,目前EL ISA法仍是临床上用于检测血浆中Ox-LDL 水平最常使用的方法。随着对Ox-LDL的深入研究以及新的检测技术的发展, Ox-LDL 检测方法可望得到进一步发展并应用于临床检测。
