流式细胞仪的功能和临床应用 流式细胞仪的临床应用

1．流式细胞仪的功能
（1）细胞参量分析
包括细胞大小、形状、蛋白荧光、氧化还原状态，膜的结构、流动性、微粘度、膜电位，酶活性，钙离子含量，pH值，染色质结构，DNA合成，碱基比例等。
（2）细胞表型分析
从1982年正式以CD(clustor of differentiation)来表达（示）白细胞分化抗原。己确定的CD序号从CDl一CD247，这些细胞表面分化抗原，可以将人体组织细胞分为T细胞、B细胞、髓样细胞、血小板、NK细胞、粘附分子、内皮细胞，细胞因子受体／趋化性细胞因子受体、干细胞／祖细胞、碳水化合物／凝集素、非谱系组共13系。CD抗原在细胞表面的获得和丢失在一定程度上反映细胞分化程度和功能状态。研究CD的意义在于①理解CD抗原分子本身的一些特性及其与免疫功能的关系；②认识和探讨CD抗原所表达细胞的功能及其在疾病发生中的作用。

（3）细胞分选
这是FCM的一项重要功能，目前FCM对细胞亚群的分选纯度可以达到99%，除了对特定的亚群加以分选外，还可以分出所需要的染色体加以分析甚至能结合PCR方法加以扩增，这多用于研究中。
2．流式细胞仪检测在临床的应用
流式细胞仪的功能决定了其在医学领域的重要地位，目前在临床上主要用于细胞表型分析、造血系肿瘤诊断和分型、移植前配型及与免疫有关疾病分析等。
（1）CD抗原与白细胞分析
①T细胞
CD₃⁺（注意下面CD分子的格式应一致）：成熟T淋巴细胞，是鉴定T细胞的重要标志，判断细胞免疫状况。
CD₄⁺_： T辅助/诱导细胞亚群
CD₈⁺_： T抑制/细胞毒亚群
CD₄⁺/CD₈⁺比值：是免疫状态标志的检测指标，正常CD₄⁺/CD₈⁺比值为1.2∽2.9,在肿瘤、免疫缺陷病、病毒感染、自身免疫病、器官移植后都有诊断、预后和治疗的指导价值，其比例降低与病变程度有关。
CD₈⁺ /CD₂₈⁺与CD₈⁺/CD₂₈^—_：前者为细胞毒T细胞（Tc），后者为抑制性T细胞（Ts）。
CD₄⁺/CD₂₅⁺与CD₄⁺/CD₂₅^—_：前者为免疫调节性T细胞，后者为效应T细胞。
CD₄⁺/CD₂₉⁺：辅助性诱导细胞，辅助B细胞产生抗体和诱导细胞介导的淋巴细胞溶解作用，自身免疫性疾病可见增多。
CD₄⁺ /CD ₄₅RA⁺与CD₄⁺ /CD₄₅Ro⁺：前者为原初细胞（naivecell）主要功能是诱导Ts细胞活化和辅助其功能活性。SLE、MS患者外周血CD₄⁺/CD ₄₅RA⁺细胞减少，后者为记忆细胞（memorycell）。
②B淋巴细胞：CD₁₉⁺是总的B淋巴细胞特异抗原，判断体液免疫状况。CD₂₃⁺为IgE低亲和力受体，分布于B淋巴细胞、嗜酸粒细胞上，增多与变态反应性疾病、肾病综合症、白血病等有关。
③NK淋巴细胞： CD₃^—/CD（16+56）⁺细胞表型。
④单核/巨噬细胞标志：CD₁₄⁺细胞
（2）CD抗原与血小板分析
分析单个血小板或血小板亚群膜糖蛋白，是血小板膜糖蛋白检测分析方法学上的重大发展，对先天性与获得性血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，尤其是评价血栓性疾病与血栓前状态发生与发展过程中血小板的活化程度及其诊断、治疗、预防等具有特别重要的意义。FCM分析血小板膜糖蛋白方法简便、快速、标本用量少、灵敏度高、特异性强、结果准确，为血小板的基础和临床研究提供了崭新的手段。
CD62p(P选择素)是一种糖蛋白，存在于血小板α颗粒以及内皮细胞中。CD62p在体内或体外刺激后，即转移至膜表面，巨核细胞也有表达。CD62p又称GMP—140或PADGEM蛋白(血小板活化依赖α颗粒膜蛋白)，它在血小板与单核细胞及中性粒细胞相互作用中起关键作用。
CD63为溶酶体膜糖蛋白，在多种细胞的表面和胞浆内，尤其是在血小板内部都能检测到，血小板活化后即转移至膜表面。
测血小板相关免疫球蛋白（PAIg）包括抗IgG、IgM、IgA有助于诊断免疫性血小板减少症。
一些血小板的胞浆中含有核酸物质RNA，可被噻唑橙（Thiazoleorange,TO）染色称网织血小板。网织血小板是刚从骨髓中释放出来的血小板，可用于血小板减少性疾病的鉴别诊断和疗效监测。

3．辅助白血病和淋巴瘤分型和诊断
FCM是血液病MICC分型法中免疫表型分析的重要手段。免疫分型可为临床指导治疗，判断预后，预测复发提供帮助。
（1）白血病系列分化抗原：
T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7、CD10
B淋巴细胞白血病：CDl9、CD20、CD21、CD22，CDl0

NK细胞白血病：CDl6、CD56、CD57
粒细胞白血病：CDl3、CD33、MPO（髓过氧化酶）
单核细胞白血病：CDl4、CDl5、 CDl1b
红血病：血型糖蛋白A(glycophorinA)，CDl3
巨核细胞白血病：CD41，CD42、CD61
（2）白血病系列非特异性抗原：
CD34+、HLA-DR⁺、CD38^-为干细胞、CD34+、HLA-DR+、CD38+为原始细胞，CD34-、HLA-DR^-、CD38⁺为幼稚细胞。
白血病细胞系列确定后，可根据系列抗原表达特点选择单抗进一步分亚型。
4．HIV和获得性免疫缺陷综合征（AIDS）
HIV主要感染CD4⁺T细胞，CD4⁺受体是病毒进入的主要途径。正常血中CD4⁺T细胞约1000细胞/ul（400---1500细胞/ul）。<400—500细胞/ul表示病毒强烈影响免疫系统。<200细胞/ul即使没有症状可确定AIDS，有预后价值。HIV感染早期CD8⁺T细胞增多，发展为AIDS则下降。
5．DNA含量分析以及细胞分化周期分析
DNA含量检测根据细胞周期动力学概念，在一个周期内可分为4个时相，依次为G1期、S期、G2期和M期，见图2。利用DNA分析软件可以确定各时相细胞的比例。能够进行DNA含量分析的标本可以是PBL，正常、病变或肿瘤组织，针吸或活检组织，石蜡包埋组织，胸水、腹水，膀胱冲洗液和体外培养细胞。
DNA含量分析的目的在于确定某一组织或细胞群体的增殖状态，引入DNA指数(D1)即DNA倍体的概念可以用于区别肿瘤的良恶性，恶性肿瘤的增殖状态。

二倍体细胞的DI=1，在临床上二倍体细胞DI在0.9—1.0之间，根据DI可以确定细胞DNA倍体。
6．化疗药物用药指导，敏感药物筛选
药物作用处理后的细胞采用Calcein-AM（Florescein-methyleneaminodiacetic acid 荧光素亚甲亚氨二醋酸）与PI染色。Calcein-AM为非荧光乙酰甲氨基酯经活细胞非特异性酯酶水解可变为荧光结合物，而死细胞不能水解因而无荧光。死细胞可被PI染成红色，活细胞不被PI染色，两者区分明显，可用以筛选药物。
7．实体器官移植配型和排异监测
可判断受者的免疫状态、免疫抑制剂疗效和全身免疫抑制程度。移植前交叉配型检测类抗原的抗体(PRA)、血管内皮细胞抗原(VEA)抗体，可以提高移植成功率。

8．细胞凋亡(cellapoptosis)检测
细胞凋亡可清除体内有害的细胞群，维持内环境的稳定。细胞凋亡阐明一些疾病的发病机制，导致疾病新疗法的出现。FCM利用光散射和荧光染色能够通过检测细胞光散射改变、膜结构和转运功能改变、DNA含量变化和DNA断裂点标记，从多方面分析和鉴定凋亡。是目前能够同时区分凋亡与坏死的唯一手段。
碘化丙啶(P1)标记FCM分析时，在细胞周期分析图中表现为G0/G1期峰前的亚G1期(sub-G1)峰。
位于细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸(Ps)，反转至外侧是凋亡早期膜结构的特异性改变。annexin-V是一种Ca2⁺依赖的磷脂结合蛋白，与PS具有高亲和力，以酶或荧光素标记的annexin-V为探针可鉴定凋亡，与PI结合经流式细胞仪(FCM)分析，是唯一可区分凋亡早、晚期（如何区分）与坏死的方法。见图3。
9．Th1与Th2细胞及细胞因子
辅助性T细胞根据其产生的细胞因子及功能的不同可分为Th1与Th2两大类。Th1细胞分泌IL-2、IFNγ、主要参与细胞免疫；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，主要参与体液免疫。两者相互调节、相互平衡，其平衡失调与多种疾病有关。应用流式细胞仪可检测细胞内细胞因子。
近年来美国BD公司提供CBA（Cytometric beadarray）,采用一系列微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测溶液中被检测物质的量。此法优点为同时可检测多项指标如人Th1/Th2CBA可检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFNγ；人炎症性细胞因子CBA可同时检测IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、和IL-12。
10．网织红细胞计数
传统技术用煌焦油蓝染料,染色涂片后,光镜下计数,方法费时且只计数1000个细胞,误差较大。使用噻唑橙(ThiazoleOrange,TO)染料,可与核酸形成荧光-核酸复合物,流式细胞仪上检测50000个红细胞求得百分率与绝对数,有助于贫血的鉴别
11．造血干祖细胞检测
骨髓移植的适应症主要有白血病、先天性免疫缺陷病、再障等。骨髓移植实质是造血干细胞的移植。CD34⁺细胞常作为多能干细胞的标志。
骨髓移植前检测CD34⁺细胞是很重要的一个步骤。样品经抗CD34⁺荧光抗体染色，可识别和定量CD34⁺细胞。

12．糖皮质激素受体（glycocorticoidreceptor,GCR）检测
测GCR常用细胞溶质放射配基受体（请确认）结合测定，它可定量，但需细胞量多、检测时间长。流式细胞仪可测淋巴细胞总GCR，此法虽半定量，但检测所需样品量少。对长期激素治疗或确定下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴功能紊乱，评估细胞内GCR水平有一定价值。
13．环氧合酶（Cyclooxygenase,COX）检测
环氧合酶（COX）是花生四烯酸合成前列腺素（PG）的限速酶。它催化产生的PG参与机体多种生理和病理生理过程。COX有两种类型:COX-1和COX-2。COX-1为结构性的“看家基因”产物,在多数组织细胞中持续低浓度表达，参与维持机体正常的生理功能。COX-2为可诱导性的，炎症、细胞因子、生长因子等刺激可使其大量表达，参与和加重炎症反应，促进肿瘤细胞增殖、新生血管形成，促进黏附、抑制免疫与抑制细胞凋亡。应用流式细胞仪可监测人血单核细胞经LPS刺激后COX-2与COX-1的水平。对炎症、血栓、肿瘤等病的发病机制、疗效和预后判断均有一定价值。
近年来应用流式细胞术检测特异性CTL细胞、细胞信号传导等亦在迅速开展。

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