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DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg /ml RNA浓度约为40μg / ml 寡核苷酸浓度约为30μg /ml（youyu底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。定量测定DNA或RNA，其中260nm读数用来估算样品中核酸浓度，1个OD260值相当于40μg/mLRNA或50μg/mLDNA。OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈1.8-2.0，OD260/OD230应大于2。OD260/OD280<2.0可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD230<2说明去盐不充分,可能是GIT污染所致,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤当你辛辛苦苦纯化出蛋白，准备下一步的实验时，如果后续实验的反应体系中涉及到DNA或RNA或寡核苷酸，那么你就有必要在实验之前测定一下你的蛋白样品中是否有核酸污染。那么，如何判断蛋白是否被核酸污染呢？用OD260:OD280比值！Warburg和Christian（1942）提出OD260:OD280比值是蛋白制品被核酸所污染程度的很好指标。当蛋白中掺入了核酸之后，OD260：OD280比值变化很明显，尤其是纯的蛋白制品中掺入了一点点核酸后，变化最明显。例如：纯的蛋白样品，其OD260：OD280比值为0.57，而掺入5%的核酸之后，该笔直上升到了1.06。但是反过来却是不成立的，即：这个比值不能用来指示核酸被蛋白污染的程度。因为核酸在260nm和280nm处的消光系数比蛋白质高很多，即使有明显的蛋白污染也不会大幅度改变核酸溶液的OD260：OD280比值。例如，纯的核酸的OD260：OD280比值是2.0，当掺入了5%的蛋白质污染之后，OD260：OD280比值变成1.99，掺入20%的蛋白质污染后，也才变成1.96。这就说明这个比值用来指示核酸被蛋白污染的程度是非常不灵敏的。从下面这个表中就可以明显看出来。蛋白质／％核酸／％ OD260:OD280 100 0 0.5795 5 1.0690 10 1.3285 15 1.4880 201.5975 25 1.6770 30 1.7365 35 1.7860 40 1.8155 45 1.8450 50 1.874555 1.8940 60 1.9135 65 1.9330 70 1.9425 75 1.9520 80 1.9615 851.9710 90 1.985 95 1.990 1002A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度原理：蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。优点：1.快速；2. 对蛋白质无破坏性。缺点：1.不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）2. 核酸可引起强烈干扰。灵敏度：0.2 mg/ml ~ 2 mg/ml；比色杯最小测量体积为0.1ml。注意事项：实验室通常认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时，蛋白浓度约为1mg/ml，这是非常不精确的。如果实验所用的缓冲液和水有较高的光吸收值，说明缓冲液中有干扰物质存在。测量方法和计算公式：对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280nm波长处的光吸收值，一般来说， 1 A280 Unit ≈ 1mg/ml (对于浓度位于0.02 mg/ml ~ 3mg/ml范围之内的蛋白样品而言如此，对于浓度小于0.1 mg/ml的蛋白样品，可以采用以下的方法估算：蛋白浓度≈ A205/31）对于存在核酸污染的蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm和260 nm波长处的光吸收值，或280 nm和205nm波长处光吸收值，按照以下公式计算：蛋白浓度（mg/ml）= [1.55 × A280] － [0.76 × A260]蛋白浓度（mg/ml）= A205 ÷ (27 ＋A280/A205) [B]tieniu03[/B] 发表于 2009-6-2821:48A260(nm)光吸收测DNA浓度利用260nm光吸收测定DNA浓度计算公式（见下图）1 A260 Unit ofdsDNA = 50 μg/ml H2O1 A260 Unit of ssDNA = 33 μg/mlH2O注意：A260的光吸收值应当落在0.1到1.0之间。因此需根据不同情况按适当比例稀释。A260/A280≥1.8代表DNA纯度可以；如果小于1.8，表示有蛋白污染；如果大于2.0则表示可能有RNA污染。A260光吸收值不能体现DNA链的长短。
