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我们纯化出钙调蛋白之后，就开始进行一些蛋白质化学的分析，主要是蛋白酶消化、反相HPLC分析、MALDI-TOF质谱之类的分析。我觉得在这个课程里面加一个质谱分析并不是那么有用，因为基本上只是演示实验，只是讲了讲皮毛而已。相比之下反相HPLC在蛋白质纯化中要重要得多。HPLC的全称是High Performance LiquidChromatography（高效液相色谱），这个名称听起来好像很尖端的样子，其实HPLC组成部件非常简单，主要是三部分：泵、柱子、UVmonitor。反相HPLC跟一般的色谱的一个显著不同是压力。为了保证纯化蛋白的分辨能力，反相HPLC柱的matrix材料颗粒非常精细，所以必须施加很大的压力才能跑得动柱子。相比之下，反相HPLC所需压力比一般gelfiltration柱子压力大十倍都不止。反相HPLC的分辨度十分惊人，远远超过其他色谱方法。分辨度高到什么地步呢，我举一个自己的例子。我原来在E. Coli里面表达EGFrepeats，大概有7-8kD的样子，然后用体外反应加上一个fucose糖基。这个fucose分子量只有146。就这么小的区别，即使跑在SDS-PAGE上也是看不出来的，但是用反相HPLC可以很完全的把没有糖基和修饰上糖基的EGFrepeats分成两个峰。可见反相HPLC有多么强大了。反相HPLC虽然很强大，但是它最大的弱点是不能用来分离大的蛋白，只能用来分离小肽或者小蛋白（比如histone）。具体说起来，大于30kD的蛋白就可能不行了。原因是洗脱相里面用的是有机溶剂，容易使大蛋白，尤其是带有很多二级结构的蛋白变性。反相HPLC为什么叫反相（reversephase）呢？这其实跟正相（normal phase）HPLC有关系。正相HPLC依靠提高流动相的极性来洗脱，而反相HPLC则相反，依靠降低流动相的极性来洗脱。正相和反相HPLC柱子的材料都是由silicagel（硅胶）构成的。反相HPLC柱子的silica gel上面还有衍生的alkyl group，所以疏水性强了许多。正相HPLC一般用来分离脂类分子。脂类分子有少许极性，如果样品溶解在有机溶剂里面，再过柱的话，可以与柱子的silicagel结合上。如果在流动相里面逐渐提高极性成分，脂分子就会被洗脱下来。反相HPLC则是用来分离蛋白质的。蛋白质有部分疏水性质，过反相柱的时候，可以与silica gel上的alkylgroup相互结合。但是如果在流动相里面逐渐提高非极性成分（比如acetonitrile），蛋白质就会被洗脱下来。大家可能注意到，反相HPLC的原理和疏水作用层析的原理很相似。但是，反相HPLC里面的蛋白质与柱子的疏水作用比一般疏水作用层析要强得多。原因就在于反相HPLC流动相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA是一种强酸，所以能很有力使蛋白质中的羧基质子化，使之不带负电，同时又能与蛋白质中正电基团形成离子对，进一步增加蛋白质与柱材料的疏水相互作用。反相HPLC具体跑起来很简单，主要是操作仪器，先把蛋白质样品和0.1%TFA的溶液混合一下，然后上样，用0.1%TFA冲洗若干分钟，使得蛋白样品和柱子结合上。然后逐渐增加流动相中的acetonitrile（乙腈）浓度，洗脱蛋白。
