摘要: 本文对鲜鸡蛋中的沙门氏菌进行前增菌、增菌及生化鉴定，从鲜鸡蛋黄中分离得到沙门氏菌，然后对得到的沙门氏菌在不同温度下加热，得到相应的致死时间。

关键字：鲜鸡蛋；沙门氏菌；生化鉴定；单一变量

沙门氏菌（Salmonella）是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。该菌广泛分布于自然界，目前全世界已经发现2 523个血清型，我国发现的血清型近300 个。许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素，以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见^[1]。常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位^[2]。有资料显示，我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的^[4]。另外，每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔，以及食品加工厂由于沙门氏菌污染，经常导致重大的经济损失。因此，对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性^[3]。

鸡蛋中含有多种丰富的营养成分，非常适宜于沙门氏菌的生长繁殖。沙门氏菌是一种常见的重要人畜共患病原菌，它不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒、流产等动物疾病，还能引起人类的沙门氏菌病如胃肠炎、食物中毒、腹泻、败血症等^[6]。鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏是家禽生产中对蛋鸡具有高发病率和死亡率的两种病原体，但它们却极少引起人类发病。相反，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是家禽常携带的两种病原体， 它们很少或根本不会引发鸡的临床症状， 但却很容易引发人类的感染。这两种沙门氏菌能够持续存在于蛋鸡卵巢和输卵管中， 直接污染蛋鸡（垂直传播）。但最常见的污染方式还是来自于污染环境的水平传播。因此对鸡蛋进行沙门氏菌检测对于公共卫生检疫、养鸡场的卫生监管、消费者的身心健康均具有重要的意义^[5]。

本文对鲜鸡蛋中的沙门氏菌进行检测，并摸索出了沙门氏菌的致死温度及时间，为人们安全食用鲜鸡蛋具有指导意义。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品鲜鸡蛋

2012年4月19日从山东省潍坊市奎文区世纪泰华福乐多早春园店内随机购买鲜鸡蛋9枚，装袋带回试验室，置于4℃冰箱内进行保存。

1.1.2培养基

缓冲蛋白胨水(PBW)；四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）；亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）；亚硫酸铋琼脂（BS）；木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂；三糖铁琼脂（TSI）；赖氨酸脱羧酶（LIA）培养基；尿素琼脂；蛋白胨水；PBW琼脂培养基。

1.1.3仪器设备

冰箱；天平；恒温培养箱；全自动高压灭菌器；超过滤净化工作台；过滤灭菌器；试管；培养皿；三角瓶；试管；移液管等试验室常用仪器器材。

1.2 方法

1.2.1前增菌

用自来水将鲜鸡蛋清洗干净，然后在超净工作台下用无菌纱布蘸75%的酒精擦洗蛋壳表面；接着将鸡蛋轻轻碰击台面磕开1cm左右直径的裂痕，用无菌镊子去掉破碎的蛋壳，随后轻轻撕破卵壳膜，将卵白全部引出流入烧杯中，再用无菌镊子将卵黄膜刺破引卵黄进入另一烧杯，混合9个鸡蛋的卵黄；用10mL无菌移液管分别移取10mL置于装有9个190mL缓冲蛋白胨水（BPW）的250mL无菌锥形瓶中。在9个锥形瓶瓶壁上分别标记代码1、2…9，最后将菌液置于36±1℃的恒温培养箱上培养，24h后进行增菌。

1.2.2增菌

用无菌移液管从9个前增菌液中分别吸取10mL，分别转接于装有100mL四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液或100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）的培养瓶中，每种增菌液做三个重复；随后在菌液壁上标记（TTB增菌标记1-1、1-2、1-3、2-1……9-3；SC增菌标记1-4、1-5、1-6、2-4……9-6）；最后将两种培养基分别置于不同恒温培养箱内42℃（TTB）及36±1℃（SC），培养18~24h。

1.2.3选择性培养

用无菌接种环在无菌环境下蘸取少许增菌液，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板（BS）和木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂平板上，标记后置于培养箱中于36±1℃培养40~48h（BS琼脂平板）及18~24h（XLD琼脂平板）。定时观察菌体在平板上的长势。

1.2.4纯培养

挑选分离培养基上的可疑沙门氏菌单菌落，用无菌接种环挑取少许菌落移接到PBW琼脂培养基斜面中进行纯培养，标记后置于中36℃培养箱培养；24h后置于4℃冰箱内保存。

1.3 生化鉴定

将分离出的菌种分别接种于三糖铁培养基（穿刺）、尿素酶培养基（穿刺）、蛋白胨水（供作靛基质试验）、赖氨酸脱羧酶（LIA）试验培养基内，置于恒温培养箱中36±1℃培养18~24h，记录结果并拍照。

1.4 致死试验

根据单一变量原则，分别以温度、时间为不变量设置梯度（温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃；加热时间分别为1min、2min、3min、4min、5min）来探究沙门氏菌的致死温度及时间。方法及步骤如下：

在无菌环境下将培养1d的菌液倾倒于5个无菌试管内，接着置于不同温度的水域中进行加热；随后的5min内每隔1min时提取出1只试管，随后在无菌环境下接种至亚硫酸铋琼脂（BS）培养基内，每只试管倒2个平板，标记后将涂布后的平板置于36℃的恒温培养箱内进行培养；24h后观察结果并得出结论。

2结果与分析

2.1前增菌

利用BPW培养基培养1d后培养基的变化如图1所示

2.2增菌

2.2.1利用四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）进行增菌

2.2.2利用亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）进行增菌

增菌培养1d后培养基变化如图3所示

2.3 生化鉴定

菌种在分离培养基上培养4d后挑选出3-2；6-1；4-5三个菌种进行生化鉴定。鉴定的结果如表1所示：

表1 生化鉴定结果

由以上图表可知三糖铁（TSI）琼脂试验中推断菌种4-5可能为大肠杆菌，菌种6-1、3-2可能是志贺氏菌；赖氨酸脱羧酶（LIA）试验中得知3个菌种均为赖氨酸脱羧酶试验为阳性，说明菌种可能为沙门氏菌；靛基质试验中得知3个菌种的靛基质试验为阴性，说明均可能为沙门氏菌；尿素分解试验中得知菌种3-2的尿素脱羧酶试验为阴性，菌种4-5、6-1的尿素脱羧酶试验为阳性。

综上所述：经初步判定菌种6-1是沙门氏菌，因此利用该菌进行致死试验。

分别对不同温度加热下依次加热不同时间的菌液进行接种、涂布、培养后菌落多少如表2所示。可见在50℃以下，加热5min仍不能杀死全部的沙门氏菌，60℃~80℃持续加热4min，即可将沙门氏菌杀死；90℃持续加热2min，即可将沙门氏菌杀死；达到100℃，即可将沙门氏菌杀死。本次试验加热的是液体菌种，与鲜鸡蛋加热还有很大区别，但值的借鉴的是，经过一定时间和温度的作用，会致死沙门氏菌，这在人们的生活中具有指导意义。

表2 菌体在平板内的长势

加热时间 温度	1min	2min	3min	4min	5min
40℃	++++	++++	++++	+++	+++
50℃	+++	+++	+++	++	++
60℃	++	+	+	-	-
70℃	+++	+++	++	-	-
80℃	++	++	+	-	-
90℃	+	+	-	-	-
100℃	-	-	-	-	-
注：有菌落用“+”表示，“+”越多表示菌落越多，“—”表示无菌落生长。

3结论与讨论

沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。沙门氏菌病除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，对易受沙门氏菌污染的食品要进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从而有效预防沙门氏菌病。为此，人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中，做出了不懈的努力^[8]。

人们食用了污染了沙门氏菌的鸡蛋及蛋制品时，如果蛋黄中的沙门氏菌不能被杀灭，可于食后的4~24h内发病，也有的潜伏2~3d发病，症状发病突然，体温升高，伴有头痛、寒战、恶心、呕吐、腹痛和严重的腹泻^[7]，对儿童的危害更加严重，可致儿童出现高热、惊厥、腹泻、呕吐、脱水。

我国农业部畜牧兽医局为了消费者的健康和养鸡业的安全生产，严格规定了切实有效净化养鸡场沙门氏菌的综合措施。首部鸡蛋国家标准《农产品安全质量无公害蛋安全要求》规定，鸡蛋内不得检出对人类危害较大的氯霉素、呋喃唑酮及沙门氏菌。但是山东省潍坊市奎文区早春园自由市场销售的鲜鸡蛋蛋黄中沙门氏菌检验阳性率高达76.7%^[6]，由此可知，虽然国家严格规定但也不能保证我们消费者购买的鸡蛋及其他蛋类能完全食用安全。

消费者购买了鸡蛋，在烹饪之前不可能进行一下沙门氏菌的检测，所以贮存和食用鸡蛋的方式至关重要。沙门氏菌在体温下能够快速生长；冷冻时，不会致死，但会抑制其繁殖；根据本次研究100℃可完全杀死沙门氏菌确保食用安全。所以购买鸡蛋后如果不能当天吃完，低温保存是必要的，以减少沙门氏菌的繁殖。喜欢喝鲜鸡蛋、蛋茶，吃溏心蛋、单面煎鸡蛋的消费者，如果形成习惯，每天或隔天都吃这些东西，无疑就食用了含有没杀死的沙门氏菌，日积月累，可能就会影响身体健康，因此劝诫朋友们，非医用须要，不要长期食用半鲜鸡蛋，尤其是鲜鸡蛋。

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