爱华网1、先确定质粒克隆的菌种是什么，是大肠杆菌、农杆菌抑或其他菌？不同的宿主菌提取质粒的产率不一样，如用的是一般克隆的DH5a、JM109等菌株，可以考虑下面几种情况
2、提完质粒后跑质粒检测的时候是同时加的酶切后的质粒电泳吗，还是质粒放置一段时间后再进行酶切后电泳。跑酶切产物的时候有否再加未酶切的质粒做对照？如果没有做对照，就应该考虑是不是质粒放置过程中发生降解；如果做了对照，而对照（即未酶切的质粒）仍然可以跑出正常的条代，酶切产物却没有条代（或者电泳孔道呈弥散状），这时考虑下面的情况。
3、虽然你换过了酶，但双酶切的buffer是否有换？如果没换，就应考虑是否是buffer的问题，或者是酶切体系中ddH2O的问题。如果排除了这两个原因，可考虑下面一个原因，也许是最重要的因素
4、提质粒的问题。以前我们遇到和你一样的问题，刚提完的质粒（未酶切）跑电泳，条代非常漂亮，可再拿来做酶切后电泳，整个用到呈现弥散状白色一片，或者什么都没有。为了解决这个问题，我们对整个过程进行了检测。
首先检测是否是融解质粒的TE问题，最后将此问题排除
然后检测是否是质粒本身的问题，酶切时同时做以前阳性的质粒酶切做对照（注意，该阳性的质粒和待检测的质粒不是同一批提取的，顺便说一句，我们也用碱裂解法），发现阳性的质粒对照条代完好，而酶切的质粒条代弥散或者空白，未酶切的待检测的质粒条代有时也跑不出来条代（尽管刚提完质粒时跑电泳检测是好的）
这时我们怀疑提质粒过程是否有问题，于是我们去别的实验室，用同样的菌液去提质粒，提完后，其中一部分用别的实验室的TE融解，一部分用我们自己的TE融解。然后酶切后电泳，结果两个的电泳图谱都非常漂亮。于是我们确定是提质粒过程中某些试剂有问题。
于是我们对溶液1，2，3全部换成新的，然后用同样的菌液重提质粒，再酶切后电泳，一切都OK了，
造成该状况的原因不是狠清楚，也许提质粒的溶液污染了，导致酶切后无条代。。。。。
这个问题，我们实验室也遇到过几次，在反复验证后，大体总结如下：
1、先确定质粒克隆的菌种是什么，是大肠杆菌、农杆菌抑或其他菌？不同的宿主菌提取质粒的产率不一样，如用的是一般克隆的DH5a、JM109等菌株，可以考虑下面几种情况
2、提完质粒后跑质粒检测的时候是同时加的酶切后的质粒电泳吗，还是质粒放置一段时间后再进行酶切后电泳。跑酶切产物的时候有否再加未酶切的质粒做对照？如果没有做对照，就应该考虑是不是质粒放置过程中发生降解；如果做了对照，而对照（即未酶切的质粒）仍然可以跑出正常的条代，酶切产物却没有条代（或者电泳孔道呈弥散状），这时考虑下面的情况。
3、虽然你换过了酶，但双酶切的buffer是否有换？如果没换，就应考虑是否是buffer的问题，或者是酶切体系中ddH2O的问题。如果排除了这两个原因，可考虑下面一个原因，也许是最重要的因素
4、提质粒的问题。以前我们遇到和你一样的问题，刚提完的质粒（未酶切）跑电泳，条代非常漂亮，可再拿来做酶切后电泳，整个用到呈现弥散状白色一片，或者什么都没有。为了解决这个问题，我们对整个过程进行了检测。
首先检测是否是融解质粒的TE问题，最后将此问题排除
然后检测是否是质粒本身的问题，酶切时同时做以前阳性的质粒酶切做对照（注意，该阳性的质粒和待检测的质粒不是同一批提取的，顺便说一句，我们也用碱裂解法），发现阳性的质粒对照条代完好，而酶切的质粒条代弥散或者空白，未酶切的待检测的质粒条代有时也跑不出来条代（尽管刚提完质粒时跑电泳检测是好的）
这时我们怀疑提质粒过程是否有问题，于是我们去别的实验室，用同样的菌液去提质粒，提完后，其中一部分用别的实验室的TE融解，一部分用我们自己的TE融解。然后酶切后电泳，结果两个的电泳图谱都非常漂亮。于是我们确定是提质粒过程中某些试剂有问题。
于是我们对溶液1，2，3全部换成新的，然后用同样的菌液重提质粒，再酶切后电泳，一切都OK了，
造成该状况的原因不是狠清楚，也许提质粒的溶液污染了，导致酶切后无条代。。。。。
1、先确定质粒克隆的菌种是什么，是大肠杆菌、农杆菌抑或其他菌？不同的宿主菌提取质粒的产率不一样，如用的是一般克隆的DH5a、JM109等菌株，可以考虑下面几种情况
2、提完质粒后跑质粒检测的时候是同时加的酶切后的质粒电泳吗，还是质粒放置一段时间后再进行酶切后电泳。跑酶切产物的时候有否再加未酶切的质粒做对照？如果没有做对照，就应该考虑是不是质粒放置过程中发生降解；如果做了对照，而对照（即未酶切的质粒）仍然可以跑出正常的条代，酶切产物却没有条代（或者电泳孔道呈弥散状），这时考虑下面的情况。
3、虽然你换过了酶，但双酶切的buffer是否有换？如果没换，就应考虑是否是buffer的问题，或者是酶切体系中ddH2O的问题。如果排除了这两个原因，可考虑下面一个原因，也许是最重要的因素
4、提质粒的问题。以前我们遇到和你一样的问题，刚提完的质粒（未酶切）跑电泳，条代非常漂亮，可再拿来做酶切后电泳，整个用到呈现弥散状白色一片，或者什么都没有。为了解决这个问题，我们对整个过程进行了检测。
首先检测是否是融解质粒的TE问题，最后将此问题排除
然后检测是否是质粒本身的问题，酶切时同时做以前阳性的质粒酶切做对照（注意，该阳性的质粒和待检测的质粒不是同一批提取的，顺便说一句，我们也用碱裂解法），发现阳性的质粒对照条代完好，而酶切的质粒条代弥散或者空白，未酶切的待检测的质粒条代有时也跑不出来条代（尽管刚提完质粒时跑电泳检测是好的）
这时我们怀疑提质粒过程是否有问题，于是我们去别的实验室，用同样的菌液去提质粒，提完后，其中一部分用别的实验室的TE融解，一部分用我们自己的TE融解。然后酶切后电泳，结果两个的电泳图谱都非常漂亮。于是我们确定是提质粒过程中某些试剂有问题。
于是我们对溶液1，2，3全部换成新的，然后用同样的菌液重提质粒，再酶切后电泳，一切都OK了，
造成该状况的原因不是狠清楚，也许提质粒的溶液污染了，导致酶切后无条代。。。。。
用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。
判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。因为用质粒转染真核细胞时，超螺旋的质粒效率最高，所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。
根据我做实验的经验，回答你的问题
1 从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。
2 酶切将质粒线性化以后，才可以用mark判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与mark比较判断大小。
3 商品化的质粒我没有直接跑过电泳。我估计应该大部分是超螺旋构像。
4 酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小
