爱华网一用EP管离心收集少许菌体（菌体的量无需太多），加入适量的灭菌水重悬，沸水10min，12000rpm离心5min，用上清做模板进行PCR。
二 菌液PCR方法：
1.用小枪头或灭菌牙签调取培养皿上少许细菌，直接加入到PCR反应体系中，涡旋，瞬时离心，再PCR。95度预变性5分钟可使细菌裂解，释放DNA;
2.取1ml菌液置于EP管中，100度水浴5分钟，10000rpm离心1min，取上清1－2ul为模板进行PCR;
3.注意：菌液PCR假阳性率高，建议在做过菌液PCR后，选取阳性菌株提取质粒PCR、酶切。操作过程避免污染。煮菌时菌液最好加1ml（用1.5mlEP管），以免EP管盖在加热过程中爆开，增加污染机会。
三 可以更简单些，菌落PCR方法：
1.用小枪头或灭菌牙签调取培养皿上少许细菌，直接加入到20-30微升水中，混匀，根据需要取适当体积的混匀菌液（2-5微升/15-20微升总体系）作为模板加入PCR反应体系中，95度预变性10分钟进行pcr即可;
2.菌液可直接取适当体积的混匀菌液（1-2微升/15-20微升总体系）作为模板加入PCR反应体系中，95度预变性10分钟进行pcr即可;
非常同意congcizui 的观点，菌液PCR假阳性率高，一定要选取阳性菌株提取质粒PCR、酶切。
四我用过更简单的办法，就是拿摇起的菌液直接作模板，无须经过100度裂解细菌和高速离心，菌液不用处理，直接加入PCR反应体系，20ulPCR体系加1ul菌液即可.
五 1，在摇菌时，挑了克隆后，在37度摇床中摇菌一般不超过14小时即可～～
2，此时即可直接用菌液做PCR，一般20ul的PCR体系中加入2ul的菌液做模板～，也可视其浓度自己摸索一下，浓度很高的话可以适当减少加入的模板量～～
六细菌培养液能直接用于PCR扩增吗？在我的实验中，细菌培养物经基因组提取后能扩增出需要的片段，但用同样的体系和条件未能从菌液中直接扩增出。这是为什么？
1同样的条件是不对的，应该先将菌落100度5分钟裂解后加入TAQ酶再进行PCR扩增。
菌落PCR的假阳性率较高，一定要做好严格的阴性和阳性对照，同是保证酶、buffer等反应体系没有污染，建议还是提取基因组DNA扩增。
2我一直是用菌液做PCR，效果很好，得到的产物非常多，至于易于污染的问题，只要严格操作是可以避免的，同时可多做几个克隆的菌液，如果有的条带很强，有的条带很弱，那么弱的很可能是被污染的，因为一般来讲，污染的体系扩增的产物应该是较少的。
在PCR反应时设置95度预变性5分钟是非常必要的，因为这时可以使细菌裂解，释放出DNA。如果将菌液处理后再PCR，那么在处理过程中会增加污染的机会。
3用菌液行PCR还有一个小窍门，省很多事，就是你在挑菌落进行培养时准备1.5ML的EP管，每个管中加入1ML培养基，用接种针挑取菌落接种于EP管中，摇菌几个小时，摇动EP管观察，如果发现有混浊即可用来PCR。我从一开始就用这一方法，非常成功，省去了准备试管的时间，并且菌液存于有盖的EP管中，用来测序，冻存非常方便。在用接种针接种时很多人担心接种不上，因此反复的挑菌落，其实大可不必，当接种针在来板上无菌落的地方冷确后，轻点菌落一下，然后在EP管中涮一下即可，肯定能接种上。
后来听我们老板说国外实验室在挑细菌克隆时也是用EP管摇菌的，尽管放心的用吧，会成功的。
T-载体自连
1 按理T载体自连是毒性致死的
2对于T载体而言，这很正常啊。一般情况下，大概有20%左右的蓝斑，在剩下的80%的白斑中，也可能存在假阳性的情况。要以酶切的结果为准，如果没有插入片段被切出，即使是白斑也没有用。建议多选几个菌落，对于个连接，至少要有6—8个菌落来筛选，如果都不是就不必找了，重新做克隆吧。
3 求教:用PMD19-Tvector做PCR产物(1000bp左右)的连接,如果载体自连的话(蓝斑)是单个载体的自连还是两个载体的自连,还是两种情况都有,或者有更多的情况?
还有他们的几率哪个较大?
答： 应该是两种情况都有。不过个人感觉T载体自连几率非常小啊
你的模板与载体的摩尔比是多少？---摩尔比是1:1,
TaKaRa的TVector发生自连是肯定的，只是多少的问题，它与我们平时自己的载体是一样的，最近做了1700bp的连接，有的克隆挑了8个才有一个阳性。注意载体与外源基因的比例控制在1：3-1：10之间，这样可以降低自连的几率；1000bp应该还是可以的，一般来说，片段越大，连接成功的几率就会变小，超过3000bp，一般来说T载体就无能为力了；从以前使用的情况看，T载体本身各批次之间的质量是不一样的，有时自连率低，有时买的自连率高。
目标片段过量，连接试试，阳性率应该挺高的，我连接900bp左右，蓝斑只有几个而已。
