爱华网一、引言
番茄中含有番茄红素和少量的B-胡萝卜素，二者均属于类胡萝卜素。类胡萝卜素为多烯类色素，不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用乙醇将番茄中的水脱去，再用二氯甲烷萃取类胡萝卜素。因为二氯甲烷不与水混溶，故只有除去水分后才能有效地从组织中萃取出类胡萝卜素。根据番茄红素与B-胡萝卜素极性的差别，用柱层析可以将它们分离。分离效果可以用薄层层析进行检验。
二、实验材料和试剂
新鲜番茄（或番茄酱）。
95%乙醇；二氯甲烷；石油醚（60～90℃）；氯仿；中性或酸性氧化铝（柱层析用）；环乙烷；硅胶G；饱和氯化钠溶液；无水硫酸钠。
三、实验步骤
1. 原料处理与色素提取
称取新鲜番茄浆[1]20g于100ml圆底烧瓶中，加95%乙醇40ml，摇匀，装上回流冷凝管，在水浴上加热回流5分钟，趁热抽滤，只将溶液倒出，残渣留在瓶内，加入30ml二氯甲烷，水浴上加热回流5分钟，将上层溶液倾出抽滤，固体仍保留在烧瓶内，再加10ml二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和两次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5ml饱和氯化钠溶液（有利分层），振摇，静置分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有疏松棉花且在棉花上铺一层1cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗，以除去微量水分。将此溶液储存于干燥的有塞子的锥形瓶中。层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。
2. 柱层析分离
取一支长15cm左右内径为1～1.2cm的层析柱，柱内装有用石油醚调制的氧化铝[2]。将粗制的类胡萝卜素溶解于4ml苯中，用滴管在氧化铝表面附近沿柱壁缓缓加入柱中（留1～2滴供以后的薄层层析用），打开活塞，至有色物料在拄顶刚流干时即关闭活塞。用滴管取几毫升石油醚，沿柱壁洗下色素，并通过放出溶剂至柱顶刚流干，从而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脱。黄色的B-胡萝卜素在柱中移动较快，红色的番茄红素移动较慢。收集洗脱液至黄色的B-胡萝卜素从柱上完全除去，然后用极性较大的氯仿作洗脱剂洗脱番茄红素（注意更换接收瓶）。将收集到的两个部分在通风橱内用热水浴蒸发至干。将样品分别溶于尽可能少的二氯甲烷中，尽快进行薄层层析。
3. 薄层层析检验
在用硅胶G铺成的薄板[3]上距离底边约1cm处，分别用毛细管点上三个样品，中间点为未分离的混合物，两边分别点上分离得到的B-胡萝卜素和番茄红素。可以多次点样，即点完一次，待溶剂挥发后再在原来的位置上点样。但要注意，必须在同一位置上点，而且样品斑点尽量小。点样时毛细管只要轻轻接触板面即可，切不可划破硅胶层。样品之间的距离为1～1.5cm。将此板放入装有环已烷作展开剂的层析缸中，盖上盖子。切勿让展开剂浸没样品斑点。待溶剂展开至10cm左右时，取出层析板。因斑点会氧化而迅速消失，故要用铅笔立即圈出。计算不同样品的R1值，比较不同样品R1值大小的原因以及分离效果。
四、注释
[1 ] 新鲜番茄浆的制备：将新鲜番茄洗净，用捣碎机捣碎或用市售的番茄酱。
[2]氧化铝层析柱的装填方法：将层析柱垂直固定于铁架上，铺上一层薄薄的石英砂，关闭活塞。称取15g氧化铝置于50ml锥形瓶中，加入15ml石油醚（顺序不能反）边加边搅，且不断旋摇直至成均匀浆液（稠厚但能流动），向柱内加入溶剂（石油醚）至半满，然后开启活塞让溶剂以每秒一滴的速度流入小锥瓶中，摇动浆液，不断地逐渐倾入正在流出溶剂的柱子中，不断用木棒或带橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使顶部成水平面，将收集到的溶剂在柱内反复循环几次，以保证沉降完全和装紧柱。整个过程不能让柱流干。待溶剂刚好放至柱顶刚变干时即可上样。
[3] 硅胶G薄层板的制备：将4g硅胶G置于一小烧杯中，加入8ml蒸馏水不断搅拌至浆糊状，倾倒在洗净的玻板上（18 x6cm），流平，或用涂布器铺板，并轻轻敲打均匀，在室温放置半小时凉干，然后移入烘箱，缓慢升温至105～110℃恒温活化半小时，取出放入干燥器中备用。
（三）β-胡萝卜素提取
1.将胡萝卜切碎,充分研磨,后放入试管
2.向试管中加入酒精
3.把试管用试管夹夹住,放入加有水的烧杯中(注意:不要将试管挨着烧杯壁)
4.用酒精灯加热烧杯(水浴加热),这样它们就溶在酒精里了
（四）β-胡萝卜素提取
一、贵重仪器
旋转蒸发器一台
ＵV-240型紫外-可见分光光度计一台
电热干燥箱一台
二、常规仪器
层析柱（20x700mm）一根
铁架台一套
锥形瓶 500ml二个
50ml五个
烧杯 500ml二个
滴液漏斗 500ml一个
量筒 500ml、50ml各一个
玻璃棒100cm一个
20cm二个
研钵一套
滴管二个
三、试剂
80-100目柱层析硅胶青岛海洋化工厂分厂
60-90℃石油醚北京化工厂AR
乙醇北京化工厂AR
乙酸乙脂北京化工三厂AR
无水Na2SO4天津市塘沽邓中化工厂CP
1% AgNO3水溶液（自制）
pH试纸
胡萝卜（自备）
四、实验步骤
1、提取
2、柱层析
3、结构表征-胡萝卜素的UV分析
具体实验步骤见讲义2-3页有关内容。
五、实验记录及讨论
1、本实验在提取操作中进行了实验性尝试，在研磨过程中加入了3g的无水Na2SO4以增强研磨强度，有利于有效成分的提取。在选用提取液时未使用乙醇，而使用了15ml乙醚，10ml丙酮X2次，10ml石油醚X5次，采用在研钵中加提取剂，研磨，然后倾其上层液体抽滤。这样避免了将混合物全部倒入漏斗，造成抽滤难以进行的后果。
2、本实验中耗时最多的一步操作是硅胶的处理过程：
第一、硅胶的预处理，我们以浓盐酸浸泡硅胶14小时，然后用蒸馏水洗涤硅胶4次后，将起进行减压抽滤，后不断加蒸馏水冲洗。在1小时之后，抽滤的水呈中性，但仍然含有氯离子。经过4小时不断的冲洗才使得抽滤液中基本不含氯离子。晾干一周后，在110℃烘箱中活化2小时。
第二、活化后的硅胶加石油醚浸泡并搅拌均匀。在装柱时，宜使用口径较大的玻璃漏斗置于层析柱上部，注入1/2高的石油醚，打开下部活塞，然后尽量均匀地将硅胶倾入漏斗，这样可以防止层析柱中形成断层(这一步是实验的关键步骤)。
3、柱层析过程中得到了二个显色带，第一个带显橙黄色，第二个带显淡黄色。从加入洗脱剂到收集完第一个显色带耗时90分钟，使用洗脱剂（石油醚/乙酸乙脂=2/1V/V）120ml，收集到约50ml。然后加入95%的乙醇进行洗脱，耗时30分钟收集到了第二个显色带，约有30ml。由实验可知以极性大的洗脱剂洗脱速度较快，而且收集的显色带较集中。如果在层析柱中有气泡或断层将影响分离效果，造成显色带较宽。
六、谱图分析
1、实验所得第一个显色带为α—胡萝卜素
参考数据为：α—胡萝卜素473（134896），444（147911），422（104713)
实验数据为：473.20（119490），445.47（137330），425.84（110090）
2、实验所得第二个显色带呈淡黄色，做旋光分析发现起具有较小的旋光度，可能是β-胡萝卜素。
