电泳(electrophoresis,EP 技术 蛋白质电泳技术手册

在外加直流电源的作用下，带电胶体微粒在分散介质里向与其电性相反阴极或阳极作定向移动，这种现象叫做电泳(electrophoresis,EP）。利用电泳现象可以使混合物质分离。

在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为常数，是该带电粒子的物化特征性常数。

不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。

　　1809年俄国物理学家Peнce首先发现了电泳现象，但直到1937年瑞典的A.W.K.蒂塞利乌斯（Tiselius）建立了分离蛋白质的界面电泳（boundaryelectrophoresis），分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术，电泳技术才开始应用。

上个世纪40年代末到50年代初相继发展利用支持物进行的电泳，如Wielamd 和Kanig等于1948年采用滤纸条做载体，成功地进行了纸上电泳。醋酸纤维素膜电泳、琼脂电泳；50年代末又出现淀粉凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

移动界面电泳，是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。

区带电泳，是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。

等电聚焦电泳，是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。

等速电泳，是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的，且因“自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。

电泳分离和免疫反应相结合，使分辨率不断朝着微量和超微量（1ng～0.001ng）水平发展，从而使电泳技术获得迅速推广和应用。

生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。

　　如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E.它们与介质的摩擦阻力f抗衡。在自由溶液中这种抗衡服从Stokes定律.

　　F=6πrvη

　　这里v是在介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不完全符合Stokes定律.F取决于介质中的其他因子，如凝胶厚度，颗粒大小，甚至介质的内渗等。

　　电泳迁移率(mbility)m，规定为在电位梯度E的影响下，颗粒在时间t中的迁移距离d.

　　d

　　m= ------------ 或 m=V / E

　　t·E

　　迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础，迁移距离正比于迁移率。

影响电泳的因素：

1．电泳介质的pH值

　　溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液。

　　缓冲液的离子强度

　　溶液的离子强度（Ionintensity）是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2.带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。低离子强度时，迁移率快，但离子强度过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定.高离子强度时，迁移率慢，但电泳谱带要比低离子强度时细窄。通常溶液的离子强度在0.02～0.2之间。

　　I=1/2∑CiZi2 (I：离子强度；Ci：离子的摩尔浓度；Zi：离子价数. )

　　0.154M NaCl溶液的离子强度为：

　　I= 1/2(0.154×12+0.154×12)=0.154

　　0.015M Na2SO4溶液的离子强度为：

　　I= 1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045

　　3． 电场强度

　　电场强度（电势梯度Electric fieldintensity）是指每厘米的电位降(电位差或电位梯度）.电场强度对电泳速度起着正比作用，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据实验的需要，电泳可分为两种：一种是高压电泳，所用电压在500～1000V或更高.由于电压高，电泳时间短（有的样品需数分钟），适用于低分子化合物的分离，如氨基酸，无机离子，包括部分聚焦电泳分离及序列电泳的分离等。因电压高，产热量大，必须装有冷却装置，否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离，还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多，使支持物（滤纸，薄膜或凝胶等）上离子强度增加，以及引起虹吸现象（电泳槽内液被吸到支持物上）等，都会影响物质的分离.另一种为常压电泳，产热量小，室温在10～25℃分离蛋白质标本是不被破坏的，无需冷却装置，一般分离时间长。

　　4． 电渗现象

　　在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载体的电泳中，影响电泳移动的一个重要因素是电渗。最常遇到的情况是γ-球蛋白，由原点向负极移动，这就是电渗作用所引起的倒移现象.产生电渗现象的原因是载体中常含有可电离的基团，如滤纸中含有羟基而带负电荷，与滤纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动。由于电渗现象往往与电泳同时存在，所以带电粒子的移动距离也受电渗影响；如电泳方向与电渗相反，则实际电泳的距离等于电泳距离加上电渗的距离.琼脂中含有琼脂果胶，，其中含有较多的硫酸根，所以在琼脂电泳时电渗现象很明显，许多球蛋白均向负极移动。除去了琼脂果胶后的琼脂糖用作凝胶电泳时，电渗大为减弱.电渗所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心，以观察电渗的方向和距离。

1．聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定.聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应，可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法，可以检出10-9～10-12g的样品，且重复性好，没有电渗作用.

　　2． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量.其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少（1～100μg），但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质，某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此时测定结果就不准确.3．聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量的结果.凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。

　　4．琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于①检查蛋白质制剂的纯度；②分析蛋白质混合物的组分；③研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体；④检验两种抗原是否相同.

最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。

系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。

样品和浓缩胶中的氯离子（快离子）形成移动界面的先导边界，而离子化的甘氨酸分子（慢离子）则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的蛋白质区域。电场推动样品中的蛋白质区域前移压缩并在分离胶前沿积聚。

此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质区域并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。

从三明治移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物，成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。

SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。

由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围，取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。

在没有交联剂的情况下，聚合的丙烯酰胺（Acr)形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺(Bis)交联后，凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，组成孔径大致相同的网络，SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。

这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。
凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。

1. SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制

⑴ 试剂

①丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N,N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

② 十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。

③用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。

④TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

⑤过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须新鲜配制。

⑥Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

⑵ 装置： 使用不连续缓冲系统要求在垂直板凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺电泳。

2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制

⑴ 根据厂家说明书安装玻璃板。

⑵确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液

⑶迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。

⑷ 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。

⑸制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液

⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

⑺在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。

样品处理液配方：

50mM Tris-HCl(pH 6.8)

100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)

2% SDS

0.1% 溴酚蓝

10%甘油

⑻浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。

Tris-甘氨酸电极缓冲液：

25mM Tris

250mM 甘氨酸 (pH 8.3)

0.1% SDS

⑼ 按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。

⑽将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。

⑾ 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色

经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。

染色液：

0.1% 考马斯亮蓝 R250

40% 甲醇

10% 冰醋酸

染色1～2小时或过夜。

脱色液：

10% 甲醇

10% 冰醋酸

脱色需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。

此方法检测灵敏度为0.2～1.0mg。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。

4. 测量并计算分子量

蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式：

M_w ＝ K(10^－bm)(1)

lgM_w = lg K －bm =K₁－bm(2)

其中M_w是蛋白质分子量；K和K₁为常数

b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率m_R。

如果用几种标准蛋白质分子量的对数作纵坐标，用各自的相对迁移率作横坐标，即可画出一条斜率为负的标准曲线。相对迁移率为：m_R=d_pr/ d_BPB

其中，d_pr、d_BPB分别为样品和BPB（溴酚兰）以分离胶表面为起点迁移的距离。

欲求未知蛋白的分子量，只需求出它的相对迁移率：

m_R未=d_pr未/ d_BPB

然后，从标准曲线上就可求出此未知蛋白的分子量。

取出脱色后的凝胶平放在两块透明投影胶片中间，赶尽气泡，在复印机上复印。在复印的凝胶图上用直尺分别量出各条蛋白带迁移的距离d_pr和d_BPB（以蛋白带的上沿或中心为准），计算相对迁移率，根据方程式：

lgM_w = K₁－bm_R

用各标准蛋白分子量的对数（纵坐标）和相对迁移率m_R（横坐标）画出标准曲线，由标准曲线再求出其他各条待测和未知蛋白带的分子量，如有可能计算其误差。

对于不同的目的，应采用不同的检测方法。用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法.

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策　

1．指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象。向上的"微笑"现象说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致.这种情况在用较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生。向下的"皱眉"现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的"三明治"底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象.

　　2．"拖尾"现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的，克服的办法是在加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液，加增溶辅助试剂.另一方法是降低凝胶浓度。

　　3．"纹理"现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的，克服办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒.

　　4． 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的，或由于加样位置偏斜而引起。

　　5． 蛋白带过宽，与邻近蛋白泳道的蛋白带相连，这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的.

　　6．蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的。虽然梯度凝胶可以提高分辨率，但与其他方法相比，常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法.为了提高分辨率，不要加过多的样品，小体积样品可给出窄带。

加样后应立即电泳，以防止扩散.选择合适的凝胶浓度，使组分得以充分的分离。

通常靠近前沿的蛋白带分辨率不佳，所以应根据分子量与凝胶孔径的关系，灌制足够长度的凝胶，以使样品不会走出前沿。

样品的蛋白水解作用也引起扩散，而使分辨率降低。水解作用通常发生在样品准备的时候，系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白，如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生。

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