爱华网关键词 DNA磷酸二酯键酶切作用氢键断裂
I “模拟实验 ”引出的问题
在高中生物学选修教材 《现代 生物科技专题 》的基因工程专题中 ，安排了一个“重组DNA分子的模拟操作 ”模拟实验。 在模拟操作中发现，用代表限制酶(E coRI) 的剪刀，剪断字条上的碱基识别序列 “G A ”和“A G ”之间的磷酸二酯键后 ，为了获取这段 “目的基因 ”，必须将代表碱基对之间的“氢键”剪断，才能产生黏性末端。
有关氢键断裂的问题，有人认为：在模拟实验中，剪刀”除了模拟剪切磷酸二酯键外，还剪切DNA 双链碱基间的氢键，但理论上此处的氢键本不是限制酶剪切的…。也有的学生认为，在获取一段DNA作为目的基因时，由于这段DNA的两端被限制酶切断后，具有双螺旋结构的DNA将会“松动”，是外力将氢键拉断的。那么，在体外DNA重组技术的实际操作中，像这种I限制酶 DNA 双链的错位切割后，在酶切位点处碱基对间的氢键是怎样断裂的呢? 是限制酶切割开的吗?还是另有什么酶的作用?或是其他什么作用呢?2 实证研究 ，没有专门的酶切割氢键
在体外DNA重组技术的实际操作中，例如“体外建成带有噬菌DNA 片段的重组质粒”L2J实验中，除了pB R3 22 D NA 、kD N A 、含有D T F、ATP 、M gC I2 、N aCl、T ris —H CI和蒸馏水等能量和营养成分的反应液外，还有限制酶Ⅲ和 T D NA连接酶，再没有加第三种别的什么酶。由此可见，在体外DNA重组技术中，酶切位点处碱基对间氢键的断裂不是什么酶作用的结果。3 DNA分子中氢键的化学本质
DNA分子是由两条反向平行的脱氧核糖核酸链以一共同轴为中心盘绕而成的双螺旋结构。 DNA以其外侧的糖基一磷酸基为骨架，而四种碱基 (A 、G 、T 、c ) 则位于链的内侧。其中一条链上的NH 2的氢原子与另一条链上的氧原子或氮原子形成氢键。通常以“0一H …0 ／N ，N—H …0／N”形式表示。3．1 键能 氢键的键能约为30 kJ／tool一200 kJ／mol，强度介于共价键和范德华力之间。由于键能小，在成键或在键断开时所需能量也很小。氢键的键能可以分解为静电吸引能、 极化能、 交换互斥能和电荷转移能等，几种能量产生的作用有所不同 ，有吸引也有排斥 。其中，电荷转移能可产生分子间的离域作用 ，但以静电相互作用为主。3．2 键长 氢键的键长(供体与受体间距离x —H …Y 中从x 至Y 的距离) 一般在 2～5 A之间，通常两倍于普通共价键键长。键长超长性可以增大D NA 分子内弱相互作用的面积。3．3 键角 氢键是具有方向性的特殊的键，最有效的作用角度为直线形。一般氢键的键长越短，所成角度越接近于直线，则氢键的强度越大；氢键越长，偏离直线的角度越大，氢键的强度越弱。
3．4 弱点 DNA 分子中的氢键在高温和强酸或强碱等理化因素作用下，容易断裂。 DNA的变性就是这个道理。4 DNA碱基对间结合能与几何结构的关系
核酸中的碱基对受到溶剂、离子、糖链骨架的影响，有的碱基对可能偏离平衡位置。不是按照最优化结构存在，表现出碱基间距离增大，碱基对偏离平面等多变性。对于每个平面碱基对，能量最低点位置约在0。当角度增加时，稳定化能逐渐降低，最终趋向排斥特征。对于每个平面碱基对，能量最低点位置约在1．9A，当距离增加时，稳定化能逐渐降低，最终趋向于零；当距离减小时，稳定化能逐渐升高，结合能逐渐由负值变化为正值，当距离减小到1．4 A 时，表现出静电排斥。5 维持DNA双螺旋结构稳定的三种作用力5． 1 氢键作用 氢键在DNA 双螺旋结构中起稳定作用；在DNA 复制过程中，通过碱基之间形成的氢键来识别配对碱基；由于氢键是两原子间静电吸引作用形成的，它参与两分子之间电荷转移所引起的能量变化，被称之为分子体系之间的弱相互作用能(London 提出)。包括静电能、诱导能、色散能和交换能。其中，色散能是来自瞬时的多极距之间的相互作用，交换能是一种排斥效应。这种相互作用能通常在几十kJ／mol以下，能量虽然很小，但在决定物质性质时却能发挥很大作用。5．2 碱基堆积力 碱基堆积力是由于杂环碱基的兀电子之间相互作用引起的。在DN A双螺旋结构中，碱基对平面垂直于中心轴，层叠于双螺旋的内侧，相邻的疏水性碱基在旋进中彼此堆积在一起。这种力与氢键共同维系着DNA双螺旋结构的稳定性。碱基由于含有电负性不同的原子而且有明显的极化特征，当碱基堆积的时候，这些电荷产生堆积能。由于碱基中电荷分布不同，所以堆积能与两个碱基间的相对位置有关，而且原子上的电荷可以使某些方向的堆积不稳定，除了永久电荷的作用外，碱基中电荷存在瞬时变化，而且使其他碱基产生诱导偶极， 这样就产生了吸引的vanderW aals 力或 London 色散力。主要贡献是Lo ndon色散力。
5．3 离子间作用力 磷酸基的负电荷与介质中的阳离子的正电荷之间形成的离子键，它可以减少DNA 分子双链间的静电斥力，因而对DNA 双螺旋结构也有一定的稳定作用。离子也与碱基间存在相互作用。6 金属离子与DNA分子的相互作用
核酸的性质受到金属离子的显著影响。在DNA双螺旋结构中，金属离子与G ：C碱基对作用的位点为鸟嘌呤G的N7和 0 6 位。由于水环境是生命存在的基本环境，所以金属离子即可以直接与碱基作用，也可以通过水分子为 “中介 ” 与碱基作用。金属离子与DNA碱基对的直接相互作用能够影响碱基间的相互作用。7 限制酶的作用机理 有关资料介绍了限制性核酸内切酶催化磷酸二酯键水解断裂的作用机理。7． 1 DNA 的水解断裂 DNA水解断裂的结果，大多是生成带有5一磷酸基和3一羟基的片段。这是一个亲核取代过程，涉及三种基团：①活化亲核水分子的广义碱；②稳定五价过渡态磷原子上负电荷的L ewis 酸(通常为二价金属离子 ) ；③促进 3一羟基离去的广义酸。
7． 2 双金属酶活性中心的作用机理 研究发现，移去金属酶中的金属离子会导致酶失活，用其他金属离子取代酶中原有的金属离子也会引酶的活性下降或失活。这说明特定的金属离子对于金属酶正常发挥活性至关重要。天然核酸酶 (如 E coR I) 分子中常含有联的双金属活性中心，并为能发挥活性所必须。例如，催化双链DNA 磷酸二酯骨架发生选择性水解断裂的DNA 内切酶 E coR I及V需要有2 个M g ( Ⅱ) ( 或 M n ( Ⅱ ))离子并与酶形成配位结构，作为活性位点。双金属中心可以发挥协调相关的生理化学性质，特别是当两个· 6 3 ·金属离子通过桥联配体 ( 如氢氧基或水分子)进行配位时更为有效，可产生双核静电效应。双金属中心可以更好地协调活性中心的结构，使之有利于结合底物分子并进一步 活化它：其中的一个金属离子(较强的 Lewis 酸 ) 使结合在其上的水分子在生理p H条件下活化，解离一个质子产生OH一离子，后者是对P原子发动亲核进攻的活性物质；而另一个金属离子则发挥结合底物、促进产物离去的作用。另外，双金属中心有利于其上电荷的离域化，降低反应活化能，并且有利于过渡态的稳定化，为产物的离去创造有利条件。同时，金属离子与磷酸酯未被活化部分之间产生静电相互作用，一方面在某种程度上促进磷酸酯水解；另一方面也可以影响酶切位点处D NA 碱基间的相互作用。8 对氢键断裂的解释 综上所述，限制酶活性中心的双金属离子在促进磷酸酯水解过程中，起活化底物(DNA分子)的作用。一方面可以促进磷酸酯水解；另一方面也可以影响酶切位点处DNA 碱基间的相互作用。换言之，酶活性中心的双核静电效应与DNA分子内的静电相互作用碰撞在一起，是与氢键断裂有关的原因。8． 1 局部电荷转移使相邻碱基产生诱导偶极 由于限制酶 (如EcoR I) 催化磷酸二酯键水解断裂后，双链DNA片段两端的5一磷酸基都带有负电荷，使双链之间产生强烈的静电排斥作用。这种作用将同时吸引DNA 分子体系内的正电荷 ，使电荷向两侧移动，打破了电荷的局部平衡，使碱基中的电荷分布不均。 这种电荷转移，使相邻碱基产生诱导偶极，使氢键与碱基间的静电作用减弱，London 色散力加大，色散能增强。8． 2金属酶活性中心的双核静电效应 由于金属酶活性中心的双核静电效应，使糖链骨架断裂而使碱基对的稳定性与几何参数发生改变。在酶切位点处，碱基对偏离了平衡位置，使碱基间距离增加、碱基平面角度增大、碱基间氢键的键长增长，其结果是稳定化能逐渐降低，最终趋向排斥特征：即氢键断裂，相邻碱基对分开。
8．3 只是酶切位点处氢键断裂 由于酶切过程是一种温和的瞬时变化，由此产生的弱相互作用能，能量很小(通常在几十kJ／tool 以下)，同氢键的键能处于同一数量级。因为是瞬时能量变化，断开相邻的一些氢键这种能量就已经耗尽，所以在生理条件下，只是酶切位点处氢键断裂，碱基对分开。而DNA 双链内部的氢键和基对不发生变化，分开的碱基也没有损伤，遗传信息没有丢失。结果DNA 片段产生黏性末端，有利于DNA连接酶(如 TDNA 连接酶) 的连接。
