爱华网生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（invivo）的功能活动是非常困难的。在实际工作中，人们常常从生物体内取出组织或细胞，在体外(invitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们的观察研究，这种方法就是细胞培养（cellculture）。有时细胞培养也称为组织培养（tissue culture），二者可作为同义语使用。
细胞培养的工作始于20世纪初（Harrison，1907），目前已广泛应用于生物学、医学的各个领域。细胞培养主要具有两个方面的优点，其一是人工培养条件易于改变并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代，因此可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。
细胞培养技术也存在着一定局限性，主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系，失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用，特定分化基因的表达减弱或停止，而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这是应用细胞培养技术应该注意的问题。
一．细胞培养的基本知识
（一）培养细胞的类型及其特点体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。
1．贴附型大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。
正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。2．悬浮型少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。（二）培养细胞的增殖过程
1．培养细胞一代的增殖过程培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间相对孤立，营养是有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（passage或subculture）。从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是细胞培养一代与细胞倍增（doubling）的概念是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增2-6次。细胞传一代以后，细胞群体一般要经过潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种后呈悬浮状态，在0.5-4h内贴附于支持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24h。随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细胞群体进入指数增长期，此期又称对数期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适于进行实验研究；此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入指数增长
2．培养细胞的生命期（life span）培养细胞的生命期指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。从体内取出细胞接种培养到第一次传代叫原代培养，一般持续1-4周。原代细胞一经传代后便称为细胞系（cellline），进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体的核型。一般情况下可传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。肿瘤细胞系可无限增殖而无衰退期，正常细胞系也可在传代期末期或衰退期发生自发转化，细胞获得永生性即永久增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。3．培养细胞的生存条件培养细胞需要特定的培养基和培养设备。
（1）培养基培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。细胞在体外生存于含各种营养成分的培养基中。培养基的种类很多，按其物质状态，分半固体培养基（如软琼脂培养基）和液体培养基两类，其中液体培养基（即培养液）使用最为广泛。用各种合成培养基配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和不同研究目的。一般情况下需添加10～20％的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度，称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，加2～5％血清含量即可，称为维持培养液。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素100μg/ml）。（2）细胞培养设备培养细胞在培养器皿中生长，浸浴于培养液，并需要特有的环境，包括一定的温度、湿度和气体成分。培养器皿主要有碟和瓶两类，材质为玻璃或塑料，现在使用一次性的塑料培养器皿日益普及。培养环境通常由CO2恒温孵育箱提供，恒定地提供37?C温度、95％湿度和一定量的CO2（通常为5%），CO2可使培养液维持稳定的pH。另外，细胞培养过程中进行换液、传代等工作时需在无菌工作台上进行。二．细胞培养的基本技术
（一）细胞分离和原代培养
原代培养也叫初代培养，指从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。
培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用低速离心法分离。培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用胰蛋白酶或胶原酶消化法使组织进一步分散，以获得细胞悬液。（二）培养细胞的传代
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离培养称之为传一代。培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁细胞的消化传代多用混合了胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）的消化液消化传代。EDTA能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。消化液使细胞脱落形成细胞悬液，然后以合适比例接种在新的培养瓶内。
悬浮细胞的传代可直接添加新鲜培养液，或离心收集后换新鲜培养液，以一定比例稀释传代。（三）细胞的冻存和复苏
培养细胞在传代中性质易发生改变,有支原体污染的危险。研究工作也要求细胞株的代数应维持在一定期限内。解决这些困难的方法就是将细胞冻存，需要的时候再行复苏。冻存前需向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），以减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”。细胞冻存在液氮中，从理论上讲贮存时间是无限的。（四）细胞培养微生物污染的检测
细胞培养过程中操作不当时，易引发微生物污染，主要污染微生物为霉菌、细菌和支原体。可用多种手段明确污染性质，从而从源头上杜绝污染。然而微生物污染一旦发生，多数无法救治。为了防止污染的蔓延，应及时丢弃污染细胞。体外培养细胞使用的器材品种较多。由于离体细胞对各种毒物都很敏感，所以细胞培养所用器材的清洗、消毒处理是培养能否成功的关键之一。一、玻璃器材
常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管等。
无论是初次使用还是培养后重复使用的玻璃器材均需要进行消毒处理。首次使用的玻璃器材应先用自来水初步刷洗，然后用稀盐酸溶液（1%）浸泡过夜，再用自来水冲洗，最后处理方法与重复使用的器皿的处理。
重复使用的玻璃器皿的处理步骤：
（1）刷洗。用软毛刷和优质中性洗涤剂刷洗，去除器皿内外表面的杂质。刷洗时注意不要用力过重，以防损坏器皿内表面光洁度，影响细胞生长；也不能留有死角。器皿数量大时，可使用超声波清洁装置，冲洗干净后晾干。
（2）清洁液处理。将刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重铬钾清洁液中。清洁液配方如下，见下表：
表 清洁液配方
名称* 清洁液浓度 25%(弱液) 50%(次强液) 75%(强液) 重铬酸钾 1000g 1000g 1000g 浓 硫酸 2500mL 5000mL 7500ML 蒸馏水(或废液) 7500Ml 5000mL 2500mL
该清洁液具有高度腐蚀性，操作时必须穿长筒胶靴，戴防酸橡皮手套，围裙和眼镜，以防清洁液溅出而灼伤。在配液时还需注意将酸缓慢放入水中，以防酸遇水放热产生酸溅出或使玻璃及陶制容器裂开而使清洁液外泄。切勿将水加入酸中，以防酸溅出。常用清洁液为75%和50%两种。
将玻璃器皿放入时最好装入塑料网袋内，再浸入清洁液中，玻璃瓶内不要残留气泡。一般浸泡12~24小时后取出。在清洁液中取出的器皿先用自来水冲洗10次以上，再用单蒸水冲洗三次以上，最后用双蒸水（或去离子水）冲洗1~2次，晾干，包装杀菌。一般用121℃磅高压蒸气灭菌20分钟。玻璃滤器使用后及时用自来水冲洗滤器表面的剩余物，然后用单蒸水浸泡，除去滤板内堵塞杂物，若用滤膜则将滤膜丢弃，加4N盐酸浸泡12小时以上，用自来水冲洗，再用单蒸水抽滤2次，双蒸水(或去离子水)抽滤冲洗、包装、121℃高压蒸气灭菌20分钟。也可用5%洁消精浸泡20分钟后，再按上述方法冲洗和灭菌。二、塑料器材
体外培养细胞中塑料器皿的使用越来越多，有进口的，也有国产的。主要有多孔培养板、培养皿、培养瓶及吸嘴。多孔培养板有4孔、6孔、24孔、96孔等规格可供选择。多数为进口产品，已消毒灭菌密封包装，使用时只需打开即可。有一次性使用的，也有反复使用的。在我国不少实验室，由于经费有限，经过清洗和消毒灭菌再使用的较多。若使用后，先用自来水浸泡冲洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，或先用2%NaOH处理之后再用3%HCl浸泡30分钟，最后用自来水冲洗干净，并用双蒸水冲洗3次以上，晾干。消毒采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法。清洗时要防止产生划痕，以免影响细胞的贴附性。所以，培养要求较高的细胞的塑料器材，最好一次性使用。
三、橡皮器材
应选择质软、耐高温、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子。新购置的橡皮制品，用自来水冲洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氢氧化钠煮沸15分钟，用自来水冲洗8次，再用4%盐酸煮沸15分钟，用自来水冲洗8次，单蒸水冲洗3次，双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或置于铝盒内，用121℃高压蒸气灭菌20分钟。
已用过的橡皮制品，先用自来水冲洗干净，然后用洗衣粉加热煮沸10分钟后，用自来水边冲边用力搅动，以充分洗净残余洗衣粉，然后用蒸馏水煮沸2次，每次15分钟，再用单蒸水冲洗2次，必要时还要用双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或放于铝盒内，用121℃高压蒸气灭菌20分钟。
四、金属器材
细胞培养中需用多种金属器材，用于解剖、取材、剪切组织及持取物件等，常用的有剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等。新的金属器材，先用纸擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟，擦干后再用95%酒精纱布擦干，包装或置铝盒内于121℃高压蒸气灭菌20分钟。已用过的金属器材，及时用酒精棉球擦干净，包装入铝盒内于121℃高压蒸气灭菌20分钟。
五、其他物品
纱布先用自来水洗净后，再用单蒸水冲洗，然后用单蒸水煮沸2次，每次15分钟，并经常用长镊子翻动，再用单蒸水洗2次，晾干后折成八层包装，用121℃高压蒸气灭菌20分钟。
注射器的针头使用后，立即用自来水（或来苏尔水）冲洗数次，冲洗出针头内的剩余物，以免堵塞针头，然后用单蒸水洗2~3次，再用95%酒精冲洗3次，包装或置铝饭盒内121℃高压蒸气灭菌20分钟。
用于细胞培养过程中的各种人工合成培养液、缓冲液和酶滤液等也需要进行除(灭)菌处理。缓冲液常用高压蒸气消毒。血清用56℃水浴灭活30分钟。人工合成培养液等酶溶液用过滤除菌。安装滤器时要防止滤膜装偏而导致过滤失效，过滤时力量不能过大、过猛，以免滤膜破裂。滤液量多，用抽滤式或加压式（正压式）过滤装置。滤液量少，可选用2.5cm直径的小号滤器，直接套在小瓶（如青霉素瓶）上，以注射器推动压力过滤。
消毒灭菌前所用的包装材料可用牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒和特制玻璃（或金属）消毒筒等，可根据器材大小、形态选用，采取局部包装或部分包装，并用线绳扎紧。体外细胞培养过程中使用溶液和培养液的好坏，直接影响到细胞的生长，配制时要十分注意。
一、平衡盐溶液
平衡盐溶液(balanced saltsolution，BSS)又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。
(一)配液时的注意事项
（1）需用新鲜的三蒸水或去离子水，按规定的先后顺序配制，称量要准确，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等，切勿搞错。
（2）物质的纯度纯度高的物质配制成的溶液质量高，因此在配液选用时要 注意。常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种类型。
（3）物质的可溶性很多用于培养用液的化学物质都很难溶解，在配制时必须设法使其溶解。如磷酸钙在碱性溶液中几乎难于溶解，因此在制备磷酸缓冲液时，需将CaCl2及磷酸氢二钠单溶后再混合，临时用NaHCO3调pH至弱碱性，以避免沉淀析出。
（4）物质的不稳定性不少物质性质不稳定，高温高压下易破坏。如葡萄糖只能在10磅下维持15～20分钟，若超磅葡萄糖就会破坏。
5、贮存液通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。
(二)几种常用溶液的配制方法
1、无钙、镁、离子溶液(1000ml)
氯化钠(NaCl)8g磷酸二氢钠(NaH2PO4H20) 0.05g
氯化钾(KCl)0.2g碳酸氢钠(NaHCO3)1g
柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20)1g葡萄糖1g
加去离子水或双蒸水至1000mL
2、磷酸盐缓冲液
甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液
磷酸氢二钠(无水)28.4g氯化钠8.77g
加去离子水或双蒸水至1000mL
乙液：0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液
磷酸二氢钠(无水)2.4g氯化钠8.77g
加去离子水或双蒸水至1000mL
甲、乙液于4℃保存，使用时按下表所示比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。表 不同pH浓度所需甲液、乙液量 (mL)3、Hanks液
pH* 甲液 乙液 6.0 12.5 87.5 6.2 22 78 6.4 32 68 6.6 45 55 6.8 55 45 7.0 64 36 7.2 72 28 7.4 79 21
(1)母液甲(20x)配法
① NaCl(A.R)160g
KCl(A.R)8g
MgSO4.7H2O（A.R) 2g
MgCl.6H2O(A.R) 2g
依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。
②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。
待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。
(2)母液乙(20×)配法
①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g
KH2PO4(A.R)1.20g
葡萄糖(A.R)20.0g
溶于800ml双蒸水中。
②0.4%酚红液 0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01NNaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保存。
待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。
(3)使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。
二、其他溶液
1、pH调节液
(1)碳酸氢钠液可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液或以CO2调节之。
(2)Hepes缓冲液是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为10～15mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节pH至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4℃冰箱保存。
2、消化液
(1)胰蛋白酶溶液它是一种黄白色粉末，易受潮，应密封放置阴暗干燥处。它的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来。常用浓度为0.25%或5%。如5%胰蛋白酶溶液配制：
称0.5g粉状胰蛋白酶，溶于100mL无钙镁离子磷酸缓冲液中，置4℃过夜使其溶解，或将称好的胰蛋白酶放入有刻度的烧杯中，先加入一半的磷酸缓冲液，在杯中放入一长短适宜、外周包有塑料或玻璃外壳的磁力棒，将烧杯放置在带有控温和控速的磁力搅拌器上，令磁棒匀速旋转搅拌1-2小时后，胰蛋白酶充分溶解，用滤纸粗滤后，再用玻璃或塑料滤器过滤除菌，分装入小瓶，4℃保存，同时做无菌试验阴性后才能使用。
(2)EDTA(乙烯二胺与乙酸或Versene)溶液EDTA是一种化学螯合剂，毒性小，对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0.02%。称0.1gVersene溶解于500mL无钙镁离子磷酸缓冲液中，15磅30分钟高压灭菌，4℃或室温保存。
(3)胰蛋白酶—EDTA的配制0.5%胰蛋白酶液96mL，1�TA液4mL，无钙镁离子缓冲液100mL。
3、抗生素溶液
为防止细胞培养过程中发生污染，一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100μg。配制时取青霉素1×106和链霉素1×106μg,溶于100mLHanks或PBS中，使其含量为青霉素1×104U/mL，链霉素1×104μg/mL，使用时每100mL培养液中加入0.5~1mL。
4、0.5%台盼兰(Trypan blue)液
称取台盼兰0.5g，溶于100mL磷酸缓冲液中，溶解后滤纸过滤，室温保存。
5、0.1%结晶紫的配制
称0.1结晶紫，溶于0.1N的100mL柠檬酸溶液中，(即2.1g柠檬酸加水100mL)，置37℃溶解24小时，分装备用。
三、培养基
维持体外培养细胞生存和生长的液相基质，称细胞培养基或简称培养液。理想的培养液必须具备以下条件：
(1)保持正常细胞渗透压及pH缓冲系统。
(2)必须供给细胞基本营养物，包括细胞合成代谢、能量代谢及微量元素等。
(3)培养液中没有毒物或抑制细胞生长的物质。
(4)各种基本成分的量合适，互相之间具有平衡关系，能精确定量调整。
(5)容易制成成品，生产简单，最好能高压灭菌。
培养基的种类较多，作用略有差别。凡是能供细胞生长繁殖的培养基称为生长液。若细胞生长快，在生长液中维持时间不长，可从瓶壁脱落下来，或者由于生长密度过大，使显微镜观察困难。为避免此现象的出现，常在细胞成片后改换成维持液，这种维持液可使细胞在数周内处于良好的状态，特性不变，可随时供应。此种维持液为无血清或低血清(2%)培养液。如199培养液不加血清就是良好的维持培养基。有时此种培养基中加入明胶或脱脂乳。还有一种由Smith设计的、含有超滤的肝消化物作为维持培养基。
(一)天然培养基(natural medium)
天然培养基主要是取自动物体液或从动物组织分离提取的物质，如血清、鸡血浆、鸡胚浸出液等。其营养成分丰富，培养细胞有效。最初的体外细胞培养大多用这种培养基。但由于成分复杂，个体差异大，来源有限，又很难标准化，所以实际工作中，往往是天然培养基结合在人工培养基中使用。如血清和水解乳蛋白是使用非常广泛的天然培养基，市场有现成产品出售，不需自制，可省去许多麻烦。
1、血清
血清是全血凝固后分离上清液而得的制品，其除了含有供给细胞生长所不可缺少的营养成分外，还使细胞合成DNA，提供细胞增殖所必须的生长因子。血清的主要成分为蛋白质、多肽、激素、氨基酸、葡萄糖、铜酸等。
细胞培养最常用的是牛血清，除了其营养价值较其他血清高，还有以下优点：
（1）它的胎盘能阻止母体的免疫球蛋白进入胎牛而没有抗体等的抑制效应物质。
（2）较易获得。牛血清共分三类：
①小牛血清(calfserum)，取年龄在6个月，体重达226kg的小牛放血致死而得。
②新生小牛血清(new born calf serum),出生5天内的小牛放血后得。
③胎牛血清(fetal borvineserum)，以无菌手术剖腹后取胎(210～300天胎龄)，穿刺心脏采血制得。
一般市售血清均为混合血清，有成分互补的优点，更适宜于细胞生长。
购置的血清应做热灭活处理。将小牛血清置于56℃水浴中灭活30分钟，以破坏补体及一些污染微生物(如病毒、支原体等)，放置4℃冰箱中，无菌试验阴性。未灭活的血清不稳定，应保存于-20℃冰箱中。
血清虽对细胞生长极为重要，但其成分复杂，作用机制尚未完全了解，加上供血动物的个体差异，其中有些成分对分析细胞生物学反应不利，有的甚至对细胞有害。所以在生长液中血清使用浓度为10%～20%，维持液为2%～3%，有时根据培养目的，甚至需要用无血清培养基。
2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin)
水解乳蛋白也是一种常用的天然培养基。它是乳蛋白经蛋白酶和肽酶混合物水解而得的制品，为一种均匀淡黄色或灰黄色粉末，有潮解性，故常密封保存在阴凉干燥处。其水溶液呈弱酸性，不溶于醇或醚。常用浓度为0.2%～5%，用平衡盐溶液配制。0.4%浓度的水解乳蛋白经分解后几乎与人血浆中氨基酸成分相当。在此培养基中再加入血清，可培养很多种细胞。市售产品每批都有差别，应先预试。
0.5%水解乳蛋白的配制：称取0.5g水解乳蛋白粉末，用少许灭菌的Hanks液调成糊状，再补充Hanks液至100mL，待充分溶解(室温置1~2h)后，粗滤分装，以115℃20分钟高压蒸汽灭菌，无菌试验阴性，置4℃冰箱保存备用。
3、酵母浸出液
该液在无血清蛋白存在时可促使细胞增殖。酵母浸出物中有几种结合蛋白的物质对增加细胞的生长率特别有利。它还含有丰富的维生素，故天然培养基中也常加有酵母浸出物成分，常用浓度为0.1%。
4、鸡胚浸出液
鸡胚浸出液含有生长因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，可刺激细胞生长增殖，几乎各种组织细胞培养物都可使用。常用浓度不能超过30%。近几年，由于培养基的广泛使用，鸡胚浸出液的使用已大为减少。
鸡胚浸出液的制备：取孵育10～20天的鸡胚，用洗液洗三次后剪碎或搅拌后加入Hanks液并搅均匀，注意气囊、膜囊和尿囊膜必须剥离去除。置室温或在37℃下孵育30分钟或更长时间，并采取冻融方法以助析出浸出液。2000r/min离心沉淀20分钟，取出上清，作无菌试验阴性，加双抗；分装后低温保存，也可采用过滤法除菌。
5、鸡血浆
鸡血浆含有纤维蛋白原和其他一些营养成分，是使用最早的天然培养基。缺点是易于液化，故很少单独使用。
鸡血浆制备：在无菌条件下配制0.2%生理盐水肝素液，115℃20分钟高压灭菌或过滤除菌，分装入小瓶。取消毒过的干燥注射器先吸少许肝素，湿润针管内壁，选择年幼的鸡，从翼静脉采血。3000r/min 离心10分钟,分装入小瓶,于-20℃冰箱保存备用。
6、胰酶消化牛心肌浸液
该浸液主要用作支原体检查。制备方法如下：
（1）新鲜牛心用蒸馏水洗两次，切开除去内膜、脂肪及结缔组织等，用绞肉机将心肌绞碎，称取250g加双蒸水900mL，加NaCl5g，放入三角烧瓶内。
（2）56℃水溶加温10～20分钟，再加入胰酶2.5g，待胰酶全部溶解后用NaoH调节pH至8.0，以增强消化能力，于56℃消化2小时，并不断搅拌，保持pH8.0左右。
（3）将心肌消化悬液用HCl调至pH6.0左右，煮沸5-10分钟，再用四层纱布滤去肉渣，略加压力将肉汁挤出，将浸出液加双蒸水至1000mL。
（4）加酵母浸膏1g搅拌之，调pH至8.0再煮5分钟，四层纱布（中间垫一层脱脂棉）过滤，再用cp滤纸过滤，pH保持在8.0，即成牛的心肌浸液，115℃15分钟高压灭菌，置4℃冰箱保存备用。
(二)人工合成培养基
天然培养基的来源是有限的，要进行大量体外细胞培养，需要选用人工合成的各种化学物质配制而成的、又利于细胞生长的培养基。1950年，Morgan提出了包括69种成分的199配方，开始了人工合成培养基的历史，它是在平衡盐溶液中加入标准的化学营养物质而构成的培养基。随着生物化学的飞跃发展，人们不断应用生化提纯或人工合成的各种化学物质设计出许多种合成培养基的配方，企图找到最有利于组织细胞生长的培养液，如199，Eagle、RPMI1640、HAMF12、NCT109等。
1、人工合成培养基的优点
人工合成培养基具有以下优点：
（1）人工培养基是用已知成分配制，培养条件一致。
（2）它可以精密地测定培养的细胞与培养液内物质变化的情况，用生化定量的方法可以分析各种组织以及各种实验条件下不同组织细胞的生长和代谢，这也可提供和筛选更加有利于细胞生长的更趋简化的培养基。
（3）用人工培养液培养的细胞比较透明清楚，胞浆内的颗粒很少，换液时间可适当延长，从而节省人力、物力。
（4）人工合成培养基克服了天然培养基中可能潜在病毒污染的缺点，有利于培养和研究病毒。
（5）培养基成分便于储存和大量配制，便于细胞大量生产。2、人工合成培养基的成分
人工合成培养基的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些辅助物质。这些营养物质的主要作用见前一章。
随着科学技术的进步和细胞培养技术的发展，人工合成培养基不仅品种增加，配方相对固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培养基成分趋于简单化。现今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培养液比以前已有了较大改进，增减了一些成分，以满足细胞培养中新技术的需要。如杂交瘤技术中常用的DMEM培养基，使用时需补加丙酮酸钠和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促进分裂原的反应和DNA合成，增加细胞转化。2-Me常配制成0.1mol/L的贮存液，用时每升培养液加0.5mL。PHA有市售的商品。
3、几种常用人工合成培养基的配制
(1)RPMI1640培养液称10.4g粉末(市售进口产品一般为一包)，溶于1000mL三蒸水中，待溶解后通入CO2约5分钟，至液体呈柠檬色后加入0.3g/L谷氨酰胺，或先用1N HCl调至pH6.8以下，后用1 NNaOH调至pH7.2～pH7.4；用无菌玻璃滤器或金属滤器0.22μm或0.3μm微孔滤膜过滤除菌，按所需量分装,置低温保存。
(2)Eagle基础培养基称9.4g粉末(一小包)加入1000mL三蒸水中，待完全溶解后采用121℃高压蒸气灭菌15分钟，临用前按比例加入谷氨酰胺，并用10%NaHCO312.5mL～22mL(或通入CO2)，调pH7.２～pH7.4，过滤除菌，低温保存。
(3)生长培养液根据各种细胞培养的需要，在配制人工合成培养基时，尚需加入一定量的天然合成培养液，构成最适合细胞生长的培养液，加入适量血清的生长液就是其中的一种。这种培养液主要为细胞生长增殖之用，所含血清比例较大。一般配法：基本培养基80%～90%，小牛血清10%～20%，并加双抗生素(青霉素100U/mL，链霉素100μg/ml)，上述比例如有特定需要，可根据细胞培养要求进行增减。
(4)维持液这也是在基础培养基上配制的细胞培养用液，主要作用是维持细胞缓慢生长而不死。一般血清含量较少，通常基本培养基为97%～98%，小牛血清3%～2%。
(5)无血清培养基因血清所含成分复杂，同时也含有一些不可控因素，细胞毒性物质和抑制物，不仅影响细胞生长和细胞某些功能的表达，有的还会对细胞产生去分化作用，影响一些基础医学研究的结果。因此，一些技术要求和研究目的较高的细胞培养，如细胞生长因子研究和制备、单克隆抗体制备、细胞分泌产物的研究和制备等，都须用无血清培养基，以减少或去除异种蛋白及干扰因素。不仅对产品纯化提取有益，而且可避免异种血清所引起的过敏反应。
无血清培养基主要有基础培养基和辅加成分组成，基础培养基一般用人工合成培养基，最常用的是HamF12和DMEM培养基1:1混合。然后补加15mmol/LHepes1.2g/mL，NaHCO3作为基础溶液。辅加成分有：
①促贴壁附着成分，如纤维粘连蛋白，层粘连蛋白胶原等。
②促生长增殖成分，如 一些生长因子和激素。
③蛋白酶抑制物，如 大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybeantrypsin inhibitor）。
这些辅加成分根据细胞生长条件和实验要求添加。一般先配好储存液，过滤除菌，低温保存，要避免反复冻融。使用浓度和使用方法各不相同。如纤维粘连蛋白的配制浓度为25mg～50mg/L，用时先涂在培养瓶皿支持物上；层粘连蛋白1mg～5mg/L，可直接加在培养液中。成纤维细胞生长因子配制浓度2mg/L，使用浓度5μg/L，可直接加入培养液中；大豆胰蛋白酶抑制剂，使用浓度为0.1%～0.5%，通常配制在基础培养液中。人和动物体内绝大部分组织都可以在体外培养，但其难易程度与组织类型、分化程度、供体的年龄、元代培养方法等有直接关系，元代取材是进行组织培养的第一步。
取材的基本要求
（1）却才的组织最好尽快培养。因故不能即使培养，可将组织浸泡于培养业内，放置于冰浴或4度冰箱中。如果组织块很大，应先将其切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。
（2）取材时应严格无菌操作，用无菌包装的器皿或用事先消毒好的，带少许培养液的小瓶等便于携带的物品取材，取材过程中要尽量避免紫外线照射和接触化学试剂如碘、汞等。从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材时，为减少污染，可用含500~1000单位/ml的青,链霉素BSS液漂洗5~10min,或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再做培养.
(3)取材和原代培养时,要用锋利的器械如刮脸刀片切碎组织,尽可能减少对细胞的机械损伤.
(4)对于血液.脂肪.神经组织.结缔组织和坏死组织,取材时要细心出去,修剪和切碎过程中,为避免组织干燥,可将其浸泡于少量培养液中.
(5)原代培养,特别是正常细胞的培养,应采用营养丰富的培养液,最好添加胎牛血清,含量为10%~20%为宜.
(6)一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养,分化底的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养.如无特殊要求,可采用易培养的组织进行培养,成功率较高.
(7)为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养后与原组织的差异性,原代取材时要同时留好组织学标本和电镜标本.对组织的来源.部位.包括供体的一般情况要做详细的记录,以备以后查询.
取材的基本器材和用品
(1)眼科组织剪.弯镊.手术刀(用前消毒)
(2)装有无血清培养基或Hank's液的小瓶
(3)小烧杯(10ml,50ml)
(4)培养皿(特殊用途物品详见后面章节)
皮肤和粘膜的取材
皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要组织来源.一般皮肤黏膜主要取自手术过程中切除的部分组织,如特殊需要也可酌情单独取材.方法似外科取断层皮片手术的操作,但面积一般2~3mm2即可.这样局部不留疤痕.注意取材时不要用碘酒消毒.
皮肤黏膜培养多是以获取上皮细胞为目的,因而无论何种方法取材都不要切取太厚并要尽可能去除所携带的皮下或者黏膜下组织.如欲培养成纤维细胞则反之,皮肤.粘膜分布在机体外部或与外界相通的部位,故表面细菌.霉菌很多.取材时要严格消毒,必要时用较高浓度的抗菌素溶液漂洗.
内脏和实体瘤的取材
人和动物体内所发生的肿瘤及各脏器是较常用的培养材料.内脏除消化道外基本是无菌的,但有些实体瘤有坏死并向外破溃者可能被细菌污染.内脏和实体瘤取材时,一定要明确和熟悉自己所需要组织的类型和部位,要去除不需要的部分如血管.神经和组织间的结缔组织,取肿瘤组织时要尽可能取肿瘤细胞分布较多的部分,避开坏死液化部分.但有些复发性.浸润性较强的肿瘤较难取到较为纯净的瘤体组织,其肿瘤组织与结缔组织混杂在一起,培养后会有很多纤维细胞生长,给以后的培养工作增加困难.对于一些特殊细胞培养的取材,详见后面的有关章节.
血细胞的取材
血液中的白细胞是很常用的培养材料,常用于进行染色体分析.淋巴细胞体外激活进行免疫治疗等.一般多采用静脉取血,微量时也可以从指尖或耳垂取血.为防止凝血重用肝素抗凝剂,抗凝剂的量以产生抗凝效果的最小量为宜,量过大易导致溶血.肝素常用浓度为20U/ml,抽血前针管也要用浓度较高的肝素(500U/ml)湿润.抽血时要严格无菌.
骨髓.羊水.胸水.腹水内细胞的取材
要根据各种有关操作规程进行.详见以后的章节.这几种样品取材后一般不需要其它处理,离心后最好立即培养,不易低温保存.
鼠胚组织的取材
由于鼠胚组织取材方便,易于培养,同时与人类相近都是哺乳类动物,已成为较常用的培养材料.因为小鼠的毛中隐藏微生物较多,而且不易消毒.所以取材时更要注意无菌消毒,其无菌消毒一般采用以下方法进行:首先用引颈法杀死动物,然后将其整个浸入盛有75%酒精的烧杯中5min,注意时间不能太长以免酒精从口和其它孔道进入体内,影响组织活力.取出后放在消毒过的小木板上,用消毒过的图钉或大头钉将其固定.然后用眼科剪和止血钳剪开皮肤解剖取材.也可在酒精消毒后,在动物躯干中部环形剪开皮肤,用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾把动物反包,暴露躯干,然后在固定解剖取材.区号的组织要放置在另一干净的平皿中或玻璃板上进行原代培养操作.动物消毒后的操作宜在超净台内或无菌环境中进行。
细胞培养的必备设施 根据体外培养细胞生长特点和条件，拥有一个无菌实验室、一台超净工作台和一个恒温培养箱是细胞培养的三大必备设施。
一、无菌实验室
无菌实验室或操作室的设计原则是，有防止微生物污染和有害因素的影响措施，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。无菌实验室最好能单独设置。如果条件有限，只能限制在一个大实验室内，应划分不同的功能区或用铝合金隔板隔开，将无菌操作室与清洗、消毒灭菌区、制备、储藏和孵育区分开。
无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域。亦可把净化工作台置于操作室中，这样更为安全。此室最好能与外界隔离，不能穿行或受其他因素干扰。操作室的大小依需要而定，一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。更衣间放在外，主要供更换衣帽、鞋子等。缓冲间位于更衣间与操作间之间，也可同时和几个操作间相通。操作间放在内间，主要供无菌操作和细胞培养，房间应不受日光直射，大小适当，高度适宜(2.5m)。房间过大，清扫和消毒不便；过小，操作不便；顶部过高会影响紫外线的有效灭菌效果。墙壁应光滑无死角，以便清洗和消毒。工作台不应紧靠墙壁放置，台面漆成白色或灰色，以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。若能购置超净工作台则更好。无菌操作间应为密闭式，设置空气消毒用的紫外线灯、空气过滤净化器和恒温装置。如果条件有限，仅做一般要求的细胞培养，在相对狭小的空间内，只设置净化台而不设操作室。但要注意季节气候环境的影响和注意无菌操作环节。做要求较高的细胞培养，最好设置无菌操作室，有条件的应设净化工作室，以避免季节影响和杜绝污染。
二、净化工作台
也称超净工作台。目前大多数从事细胞培养工作的实验室都已装备了超净工作台。这种工作台占据空间小，安装方便，操作简单，投资少，效果不比无菌操作室差，即使不设置单独的无菌实验室，只要购置安装了超净工作台，也能进行简单的细胞培养工作。
超净工作台种类繁多，但主要有三大类：一类是测流式；第二类为流直式；第三类为外流式，或称为水平层流式。它们的基本工作原理大同小异：内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器过滤净化后，让净化空气徐徐通过台面空间，使操作区构成无菌环境。它们的区别在于气流的方向不同，侧流式即净化后气流由左侧或右侧通过台面流向对侧；直流式为气流从上向下或从下向上流动；外流式为气流向操作者方向吹来。这三类工作台各有利弊。侧流式和直流式能形成气流屏而保持操作台无菌，但在净化气流和外界气体交界处可因气流的流动形成负压，使少许未净化气体混入，有可能发生污染，尤其在多雨季节的南方，会增加污染机会。外流式工作台因气流面向操作者流动，外方气流不易混入，但在做有害实验时，对操作者健康不利。使用此类工作台一般可用有机玻璃将上半部遮挡，让气流从下方通过，以尽量减少其不利影响。现在很多实验室普遍使用的侧流式工作台,是一种封闭式的工作台,两个侧面各留两个圆洞，供操作者手臂伸入进行操作，污染机会极少。但要拿取较大物品或进行较大范围的操作就不够方便。
超净工作台作为一种设备也需要维护和保养，才能延长其使用寿命。一般应注意以下几点：
（1）超净工作台一般宜安装在避免日光直射、清洁无尘的房间内。若能放在无菌操作区内则更佳，不仅效果好，而且滤器（料）的使用寿命长。
（2）久未使用的工作台在使用前应进行彻底清洗、消毒灭菌。用1:1000的来苏儿或75%的酒精擦洗台面，滤器械的灰尘可用真空吸尘器清除。停止使用时最好用作防尘布或塑料布套好，避免灰尘积聚。
（3）净化工作台内不应放置其他与细胞培养无关的用品，更不能用作储存室。每次使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机，然后进行培养操作。
（4）不设在无菌操作区内经常使用的净化台，要注意过滤器的效果。一般2~3年更换一次，3~6个月拆下清洗一次，以保持过滤器的净化效果。
三、恒温培养箱
用于细胞培养的培养箱分变通电热恒温培养箱和CO2培养箱。温控变化一般不超过±0.5℃,最适温度为37℃。因此要求培养箱具有较高的灵敏度。控温装置的优劣是电热恒温箱质量的关键，选购时一定要注意。一般选购隔水式或晶体管式控温培养箱，适用于封闭式的培养。
CO2培养箱在细胞培养实验室已得到普通的使用。它能提供较为恒定的CO2，通常为5%，使培养液的pH保持稳定，适用于开放式或半开放式的培养。需要注意的是：为了避免污染，要对培养箱定期进行消毒，如有紫外灯则用紫外线消毒，如无紫外灯须用酒精定期擦试消毒。另外，要维持箱内温度、湿度的恒定，可用无菌蒸馏水定期注入外箱内，或用无菌潮湿的纱布置于托盘内，然后将培养皿、培养板置于上面，再放入CO2培养箱，以保持湿度，避免培养液蒸发而影响细胞生长。
四、其他设备
进行细胞培养除了上述三大设备外，还需配备电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜和倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、消毒器、抽滤装置等。
电热干燥箱：主要用于烘干热消毒玻璃器皿，也可用于干热消毒。在用于干热消毒时，温度一般要求达到160℃(灭菌)或180℃(去除热原)，消毒时间须在2h以上。细胞培养实验室常用的干燥箱为鼓风式电热干燥箱（规格为5605mm×500mm×500mm），虽然升温较慢，但温度均匀，效果较好。鼓风与升温同时开始，待温度达100℃后再打开，以避免玻璃器皿突然遇冷而炸裂损坏。金属解剖器械、塑料制品、橡胶制品等不能放在干燥箱内灭菌。
冰箱：一般用双门冰箱，既有4℃左右的冷藏区，又有-20℃以下的冷冻区。如条件许可，应有一台普通冷藏冰箱和一台低温冰箱（<-70℃）。前者主要用于储存培养液、生理盐水、Hanks液、试剂等培养用的物品和短期保存的组织标本。后者用于保存需较长时间存放的制剂，如酶、血清和组织标本等。冰箱应保持清洁，防止污染。禁止存放有毒、易燃、易挥发物品。
显微镜：应有一台普通显微镜和一台倒置显微镜。前者用于细胞计数和一般观察，后者用于观察细胞的生长情况和有无污染。若条件许可，应配置照相系统和荧光显微镜。
水纯化装置：这也是细胞培养不可缺少的设备。因为体外培养细胞对水的要求较高，无论是细胞培养液还是配试剂等都应使用两次以上蒸馏的双蒸水。离子交换装置处理的水因为不能完全去除有机物而极少应用。外售蒸馏水常用金属器蒸馏，易混入金属离子，须用玻璃蒸馏器重新蒸馏一次后才能使用。目前国内普通使用的是自动双重纯水蒸馏器(碳管加热)，较为安全、方便、蒸馏速度也较快，但不宜直接用自来水蒸馏。配制培养液的水应用配液前蒸馏的新鲜三蒸水。
细胞冷冻贮存器：主要是液氮容器。国产的能满足要求。容积大小根据实验室需求选购。一般小实验室用35L3的，大实验室，多可购50L3的。窄颈瓶维持液氮时间长（1月左右），但存取不方便。宽颈瓶存取方便，但维持液氮时间短（7~10天）。定期加液氮的时间可据此来确定。由于液氮温度达-196℃，使用时要防止冻伤手。
离心机：一般应配有普通离心机，最好应配置高速冷冻离心机。普通离心机转速在4000r/min以下，台式的就可满足要求。用于制备细胞悬液、漂洗、分离细胞。若开展细胞脱核、DNA和RNA抽提、组织匀浆等研究，需使用高速、大容量和能进行调温的离心机。
清毒器：一般常用小型手提式高压蒸气消毒器。它可用于无法干热高温烘烤消毒的各种塑料培养用品、橡胶制品等的消毒。
抽滤装置：玻璃滤器和金属滤器。滤器中的滤膜一般用0.2～0.3μm孔径的微孔滤膜。凡在高温或射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合成培养液、血清、消化用胰酶等都须用滤器过滤除菌。细胞培养现在不局限于对细胞简单的培养使用，越来越多的研究向深处，比如研究细胞长时间生长的过程，对细胞进行电刺激会有何影响？？或是灌流药物对比分析细胞的不同变化?等等，这些必然要面对的一个问题：什么产品能够提供上述实验的成功进行？我想现在正在流行的活细胞培养装置则实现了研究人的梦想！！
本文主要介绍一下你要完成上述实验你必须具备哪些配置？？和主流的活细胞培养装置有哪些？？一活细胞培养具备的配置任何生物组织的观察当然离不开显微镜的存在，倒置显微是必须的。如果你仅是观察，那么加上活细胞培养装置（咨询厂家）即OK了（当然细胞的前期培养所需要的溶剂，工作台啊等参考1-5的文章），最后做了实验，不拍照感觉不过瘾，那就装个CCD好了。看上去简单了哦！二主流的活细胞培养装置1PeConPeCon专为活细胞显微镜工作者提供产品，他们为特定型号和品牌的显微镜设计合适的产品，包括加热和制冷、二氧化碳、氧气、蒸发的控制设备，是一家德国公司。2 Live Cell instrument(LCI) LCI是一家专业从事活细胞培养装置设计、研发和生产的公司，公司的产品采用磁吸式组配专利方案设计，取代了传统一次性培养皿的浪费，组装简单，不会挤压玻片，损伤细胞，具有TC,WP,IC三大系列，客服了一台培养装置标配一台显微镜的困境，LCI一套系统可以适用于几乎任何显微镜的使用。3 WarnerInstrumentsWarner Instruments是HarvardApparatus的成员之一，给生命科学研究者提供大量设备和附件。他们设计制造的产品包括各种培养箱和培养系统，都可以用于活细胞成像。4 WillCoWellsWillCoWells公司位于荷兰，是医学和实验室产品制造商。公司供应专为组织培养设计的玻璃底培养皿，这些培养皿可由格栅，或在玻璃的外表面上附有氧化铟膜。5 Life ImagingServices主要提供活细胞显微镜相关设备，包括数据的展示。Ludin成像培养室和显微镜温度控制系统是他们的主打产品。细胞培养中常见的污染情况总结如下:
常见的污染如下：
1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！
可在培养液中加相应的抗生素处理
2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作
3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/mlTylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话,建议用8ug/ml的浓度。
4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。
5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等
关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长就是操作的问题。
也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
2、超净台取材器材培养液培养瓶操作等因素
3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染
4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。
细胞培养常见问题及其解决
1、如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2、何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS,HS ?
FBS (fetal bovineserum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum)则是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 %CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、Hank's平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
HBS和 EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
8、细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
9、悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
10、冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后， 须立即放入37°C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。
11、细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
12、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。
13、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速，将造成细胞死亡。
14、细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95% 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
15、DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
16、冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4°C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase长期储存。
冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20°C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
17、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
18、培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
19、应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
20、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
原则上：直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
（1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
（2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0mg/ml。
（3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
（4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。
（5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
（6）重复步骤4。
（7）在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。
21、支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
22、支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
23、侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
24、CO2培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
25、为何培养基保存于4 °C冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4 °C 冰箱中，培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH值。
26、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
27、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
28、购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。
29、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
30、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
31、什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
32、如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。
33、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
34、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
35、室温下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？
缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值。
50mM Tris-HC溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值
4°C25°C 37°C
8.18.57.2
8.27.67.3
8.37.77.4
8.47.87.5
8.57.97.6
8.68.07.7
8.78.17.8
8.88.27.9
8.98.38.0
9.08.48.1
9.18.58.2
9.28.68.3
9.38.78.4
9.48.8 8.5
36、如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？
我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。
37、胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：
（1）去除培养基。
（2）用2ml1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。
（3）加入2ml1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。
（4）37℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
（5）向细胞中加入2ml细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）
（6）离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
（7）用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
38、在Sf9, Sf21,和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
39、在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。
40、贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫?
这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。
41、细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？
如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。
42、无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？
当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。
43、培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？
一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
44、培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？
大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。
45、为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?
胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。
46、保存血清最好的方法?
我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
47、如何解冻血清才不会使产品质量受损?
将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
48、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。
若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。
49、为什么要热灭活血清?
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
50、有必要做热灭活吗?
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!
51、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
52、如何避免沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:
(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。
(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。
(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。
(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
