爱华网生物芯片与第二代测序技术是两种重要的高通量基因组学研究方法，在生命科学研究领域有着极其广泛的应用前景。经过近20年的发展，生物芯片技术逐渐成熟，正在向着“高密度，灵活定制，微量样品”的方向发展，从一个实验室技术发展成一个基因组学研究所依赖的，快速产生海量数据的常规手段，正在逐步走向产业化。第二代测序技术是最近几年建立的高通量技术，其特点是一次测序反应可以产生千万到亿条序列，而测序的成本大大降低，到2010年已经进入数千美元测定一个人全基因组的时代。
那么，二代测序会不会取代芯片技术呢？是不是Sanger测序（一代测序不用了呢）？下面主要针对在一个帖子上发的问题总结一下，主要讨论二代测序与基因芯片的区别与优缺点：
讨论 1 二代测序与基因芯片的区别与优缺点。
生物芯片与第二代测序都是基因组学研究的重要手段。经过近20多年的发展，生物芯片相对第二代测序而言，优势在于价格便宜，便于分析。缺点则在于必须有参考序列（因为生物芯片的探针设计就是根据参考序列设计的）。当然还有很多技术上的优缺点，这里主要讨论他们的本质，来消除很多人对于二者的误解，认为基因芯片被二代测序取代至少在目前看来还是比较片面的。
相同点：
高通量和一些应用领域上的重合（比如表达谱，SNP）
不同点：
1.本质不同：
基因芯片的本质是核酸杂交。只不过是同时进行上万个核酸杂交而已；第二代测序在本质上是PCR.先用PCR的方法构建测序文库（SOLiD的油包水PCR，Solexa的桥式PCR），随后再以“边合成边测序”或者“连接介导的测序”，得到序列信息。
2.应用不同：
由于是核酸杂交，不需要扩增。因此基因芯片是个相对封闭的系统，只能检测序列已知的片段的浓度；另外，由于不需要扩增，保真性也较好。第二代测序本质上是测序，因此是个开放的系统，能检测到那些没有参考序列的片段，并且给出序列。由于在构建测序文库的过程中有PCR放大的过程，因此相对灵敏度较高（需要高覆盖倍数的测序深度配合），但也由于PCR放大过程的不均衡性，样品中片段的内在浓度比例常常会被破坏掉。所以：
（1）microarray不能发现新序列，而NGS可以发现一些以前没有检测到的基因。![[转载]microarray和二代测序(NGS)的区别 ngs测序技术](http://img.aihuau.com/images/01111101/01010440t01d1f4518942624a34.jpg)
（2）由于NGS本质上还是PCR，在建库的过程中样本被扩增上千倍，因此样本中基因的量的线性关系会有所偏差。因此NGS定量不是很好。如果想检测基因的表达量，还是用microarray的好。
因此，基因芯片和第二代测序技术在应用上虽然有交集，但还是有差别的。如果是比较参考序列良好的物种的表达谱，基因芯片好一些，而且基因芯片发展成熟，后续数据分析较方便。而如果想发现新的转录本，或者研究基因表达的可变剪接，3’UTR的变化等等，还是用第二代测序的好。我们现在倾向于认为基因芯片和第二代测序技术是两种不同的技术，两者有交集，但更多的是不同。至于选择哪种技术，还是要看具体想解决的问题是什么。简而言之，如果是想发现新东西，做探索性的实验，用NGS好些。如果研究对象是那些已知的东西，对定量的准确度要求很高，那么还是microarray的好。还有很多研究当基因组信息未知的时候，先用NGS测序全基因组序列，再用microarray进行分析。
讨论 2.Sanger与二代测序的比较
一下问题我想用在一个网站（后面有链接）上的帖子来说明。帖子挺好的，建议大家看看
问题：现在有几株噬菌体需要测序，不知道选用哪种方法好。一类是传统的sanger法，另一类是solexa。如果用solexa测的话，小基因组可能会有比较多的gaps，拼接效果没有sanger法好，但是费用低。我们的噬菌体基因组在１００ｋｂ左右。请问我选用哪种方法好呢？谢谢！
答:如果你只有一株噬菌体的话，我建议你用Sanger法测序。100Kb的基因组很小，保守假设Sanger法测序每次能测500bp，那么理论上只需200次就可以覆盖一次基因组了，而且数据质量好，价格也不贵。
但是，如果你有好几株噬菌体的话，我还是建议你用第二代测序，因为可以设置Barcode，好几株噬菌体一起测序，这样测序的费用会大大降低。但是如果是denovo 测序的话都存在需要用sanger法补gap的可能性。
讨论 3.关于二代测序的几种方法
问题1.我想问下各个基因组测序方法之间的区别是什么？例如solex和denovo测序法。
答: Solexa并不是一种测序方法，而是一种第二次测序仪器。
目前，第二代测序的仪器主要有3家：（1）Roche 454 Genome Sequencer FLX；（2）IlluminaGenome Analyzer IIx （Solexa）；（3）ABISOLiD3。当然Illumina和ABI现在都已经发布了新的测序仪，分别是Hiseq 2000和SOLiD4。
关于测序方法，则主要是以下几类：
1、De novo测序：即从头测序，不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。
2、基因组重测序：对有Reference Sequence的物种进行测序，寻找基因差异。
3、转录组测序：对转录组(RNA)进行测序。
此外，还有第二代测序与其它技术相结合，还有ChIP-Seq；甲基化测序等。
问题2.我是在读硕士，老板说我的课题方向做某种微生物的全基因组测序。但该生物的基因NCBI上，还有必要测吗？如果要测，请问我要提供什么样品？量为多少？测序后的拼接是你们做还是我们自己做？测完后可以做什么分析？做这种低等生物的全基因组测序，周期大概多长？
答:如果已经存在参考序列，那么再测一次就叫做重测序（re-sequence）。重测序的话，可以发现基因组的改变，一些SNV，smallindel等。这些都很有意义。
例如：研究某种微生物的耐药性。那么可以将已经产生耐药性的菌株重测序，与参考相比较，发现有哪些基因发生改变，那些基因可能正是耐药性产生的根源。
如果要测序的话，提供DNA就可以了，5微克应该够了。测序后的拼接和数据分析，上海伯豪都有专门的生物信息学团队完成。测序周期的话要根据测序量来定。
问题3.请问如果要对人类的肿瘤组织进行全基因组测序，是进行de novo 还是Re-Sequence？人类的全基因组测序结果已经公布（千人基因组），但是肿瘤组织每种肿瘤、不同病理类型、不同种族差异很大。
答：对人类样本测序都是Re-Sequence。因为已经有参考序列，在NGS中，参考序列的意义是搭建一个框架，然后NGS得到的数据就可以根据这个框架搭建上去（拼接）。
虽然不同的个体，不同的肿瘤组织基因组序列不同，但是框架是一样的。NGS得到的数据依靠框架重新拼接起来，就可以得到各个组织独特的基因组序列。
讨论 4.关于SNP和GWAS
问题1.如果我要对一个病人的家系做全基因组测序，以探求其可能的致病基因，应该用什么样的方法比较好？做GWAS都有什么仪器？罗氏454是不是其中一种？
答：GWAS（全基因组连锁分析）是指比较病人群体和正常人群体之间的基因、外显子或SNP差异，从而找到致病基因的技术路线，目前比较流行。您对家系的研究不算GWAS。GWAS是散发型的Case/control的研究，一般样本量大于800例。您对家系的研究，应该算是连锁分析（linkage），需要至少垂直三代的数据。但是比GWAS还是少得多。目前比较病人群体与正常人群体之间的差异，一般有第二代测序（NGS）和生物芯片（microarray）两类。
NGS：基因组重测序（比较基因组差异）；外显子捕获测序（比较外显子编码差异）。
microarray：SNP芯片（比较SNP差异）；CGH芯片（比较基因组结构差异）
你所说的罗氏454是第二代测序的一种，可以用来做连锁分析。但是罗氏454费用较高，一般不推荐。一般推荐ABISOLiD，因为您的研究对象是人，参考序列良好，而SOLiD测序准确率高。
问题2.根据NCBI上可以得到线虫的SNP，我从一颗树上取下一推线虫（由于线虫太小，无法分离）来提取基因组，想通过再测序知道我的样本中SNP是否与数据库一致，另外还想知道SNP发生的频率是多少。请问哪种方法可以得到我想要的结果呢？
答：你的样本实际上是一个线虫基因组DNAPool。这样的样本拿来测序，得到的数据是可以与NCBI数据库比对的，你可以发现一些那棵树上的线虫种群所特有的SNP位点。但是，以此来推算SNP位点的频率是不行的。因为那个线虫基因组DNAPool是不均匀的。
举个例子，那棵树上有两只线虫A和B。A的基因组大些，为2ug；B的基因组小些，为1ug。在某个SNP位点，线虫A为C，线虫B为T。
然后你逮到了线虫A和B，然后混合提取基因组DNA。所提取到的基因组DNApool为3ug（A占2ug，B占1ug）。假设测序的扩增过程是完全线性的，那么最后的测序结果中，在那个SNP位点，67%的比率为C，33%的比率为T。
这样的测序结果，你能说在这个SNP位点C的频率为67%吗？当然是不能的。
因此。你想发现新的SNP位点是可以的。但是想估算SNP频率是不行的。
讨论 5. 关于转录组测序
问题1.请问全转录组测序，可以同时检测mRNA、miRNA及其他非编码RNA吗？
答:首先需要向您讲明一个事实。目前，第二代测序的长度有不同的选择。SolexaGAIIx的测序长度是36bp，75bp和100bp；ABISOLiD3的测序长度是25bp和50bp。不同的测序长度的费用是不同的！目前，我们通常根据测序样品长度的不同而选择不同的测序长度。例如：mRNA测序通常会需要75bp的读长，而microRNA则只需要36bp或者50bp的读长就足够了。
关于您所提的问题，技术上是可行的，我们可以以75bp的读长测mRNA的同时测其中包含的microRNA。但是在经济上是不划算的。microRNA比较短，PCR扩增倍数多，形成的cluster多，占用了很多本该属于mRNA测序的资源，而它们本身又用不完75bp的读长，所以造成浪费。
一般来讲，如果要进行 microRNA测序的话。我们希望能将microRNA分离出来，单独测序。
问题2. 请 教miRNA芯片服务和LncRNA芯片服务的价格比较简单的技术区别。
答：miRNA芯片和LncRNA芯片实际上是两类相差很大的芯片。miRNA比较短，因此芯片公司在设计检测miRNA的探针时，在探针头部加了一个发夹结构，整个探针像一个钩子一样。这样能将microRNA前体与成熟的microRNA区分开，提高检测的特异性。而LncRNA比较长，检测LncRNA的探针设计和普通mRNA一样。目前LncRNA的研究还不深入，对于生物芯片之类比较依赖于参考序列的实验技术来讲，LncRNA芯片不是很成熟。因此，如果您是想比较两组样品之间miRNA的差异表达，可以选用microRNA芯片（定量较准）。如果您是想发现新的microRNA，或者对LncRNA进行研究。我建议您使用第二代测序。
生物芯片与第二代测序技术丁香园答疑帖精选（上）
http://www.ebioservice.com/show_news.asp?id=770
生物芯片与第二代测序技术丁香园答疑帖精选（下）
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