石蜡切片常见问题及石蜡免疫荧光步骤介绍 石蜡切片免疫组化

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本实验室现正式对外开放形态学技术服务－石蜡切片，石蜡包埋，如需此技术服务者，请提前三天在线预约，以下是介绍的石蜡切片中常见的一些问题及石蜡切片免疫荧光的相关步骤．　　石蜡包埋制片术是组织切片制作最常用的一种技术。其基本步骤包括取材、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色和封片等，其中切片是最重要的环节。我们在工作实践中发现，切片制作过程中常常由于多方面的原因在切片这一环节中遇到困难，甚至导致制片失败。针对切片过程中出现的问题，我们积极寻找原因，探究解决问题的方法。现以问题一原因一解决方法的模式，报道如下。 1切片上卷且不能形成连续蜡带原因：①切片刀不够锋利。②切片刀与蜡快的角度不当。③蜡块四周留蜡边太少。④石蜡硬度过大，黏度不够。解决方法：①重新磨刀。②调整切片刀的角度。③可重新包埋或将蜡块四周熔化，再放入包埋框中补蜡，修理蜡块时组织块周围保留的石蜡以2mm左右为宜。④蜡块过硬可适当加些蜂蜡，或更换熔点较低的石蜡重新包埋。 2 切片弯曲且不能形成直带原因：①蜡块上下或左右两边不平行。②蜡块与切片刀刀口不平行。③组织块外形不整齐。④切片刀各处的锋利程度不一致。解决方法：①将蜡块四边反复修平对称。②调节蜡块夹持器，使其与切片刀平行。③修整组织块时，注意修切整齐。④移动切片刀，更换刀口位置。 3 切片上出现裂纹 原因：①切片刀上有小缺口，或刀口不平整。②组织中可能含有较硬之物质，如固定液之结晶石灰质。③包埋时石蜡冻结太慢。解决方法：①切片刀某处有缺口，可调换刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口过多且不平整，可先将刀锋垂直在磨刀石上轻轻磨数次，然后按常规磨刀田。②组织中硬性物质太多，则不宜用。③纠正包埋时的缺点。一般待蜡块周围凝结一层，即可放入冷水中。 4 切片粘在切片刀上或蜡块上且不易取下原因：切片时有静电作用，产生静电吸引，在冬季或气候干燥时常出现这种情况。解决方法：可用加湿器．以增加空气中的水分，而减少静电作用。 5 切片厚薄不均原因：①切片微动部分失灵，齿轮跳格。②蜡块太大，过硬，转动时刀刃受震动。解决方法：①修理切片机失灵的部分，调整螺旋．加机油润滑零件，必要时需请专业技术人员调整切片机。②如蜡块过大，以后取材时注意取材的大小。蜡块组织过硬，可返回水中浸泡，再重新脱水和包埋。 6 切片碎烂或组织脱出并与石蜡分离原因：①组织脱水，透明不够。②浸蜡时间过长．浸蜡温度过高。③组织脱出是由于脱水、透明时间不够，或组织中含有乙醇等，石蜡不易渗入组织中．故导致石蜡与组织分离。④二甲苯使用时间过久。解决方法：①必须按组织大小厚薄选择脱水、透明时间。②依组织的性质和结构特点确定浸蜡时间．控制包埋温度。一般这种情况难以补救。③脱水，透明渗蜡不够，应重新熔化，退回入二甲苯和酒精，再进行渗蜡包埋。④更换二甲苯。 7 切片皱褶太多且不能完全展开原因：①石蜡太软或室温过高。②切片刀上粘有残余的石蜡，刀口不干净。③组织浸蜡时间不够．或脱水、透明不够。④切片刀不锋利。解决方法：①可将蜡块放入冰箱中冰冻后切片．并在切片时一边切片一边用冰块冰冻或换蜡。如室温过高，可开空调降低室温。②切片刀不干净，可用棉花沾少许二甲苯将刀口拭干净。③组织浸蜡不够，可重复浸蜡过程。④将切片刀磨锐利再行切片。


石蜡切片免疫荧光步骤：包埋好的标本用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。 经60℃烘片2-8小时（都试过，没啥差别，但非实质性器官应适当延长时间）。 二甲苯Ⅰ脱蜡30分钟（若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60℃），二甲苯Ⅱ脱蜡10分钟。 梯度酒精复水：100%酒精3分钟，100%酒精3分钟，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟,75%酒精3分钟，50%酒精3分钟，蒸馏水3分钟，蒸馏水3分钟，PBS 5分钟。 进行抗原修复：将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力三分钟至微微沸腾，再用50火力维持7分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。 用PBS3分钟，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（无色的5�S或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液）在湿盒中37℃封闭30分钟（室温30分钟也可）。 用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜（37℃1小时多也差不多），再用PBS3分钟×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。 滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，用PBS3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加DAPI 避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。用PBS1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。 最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察。

  
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