爱华网单增李斯特菌的调查报告
一、单增李斯特菌的概述
生活中李斯特菌到处存在，但其中只有一种为致病菌。李斯特菌可从各种食品样本中分离出来包括乳制品、肉类、蔬菜和海鲜，也可从食品加工过程中的环境中分离而来。
李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株：
（1）单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes/L.mono)
（2）绵羊李斯特菌 (Listeria iuanuii)
（3）英诺克李斯特菌(Listeria innocua)
（4）威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)
（5）西尔李斯特菌 (Listeria seeligeri)
（6）格氏李斯特菌 (Listeria grayi)
（7）默氏李斯特菌 (Listeria murrayi)
其中单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes/L.mono)是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
在美国LM被列为7种主要的食源性致死病菌之一,已经被WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病原菌之一。LM为需氧或兼性厌氧菌,生长温度为1~45℃,对不利环境具有较强的耐受能力,在4℃冰箱中也可生长繁殖,在pH5.0~9.0的环境中,1年后仍可检出,这使其危害性进一步增大。另外,LM病原体定居在细胞内,因此应用抗生素治疗效果不理想。由于LM引起的疾病及其食源性感染日益引起世界各国的重视,对该病建立快速、灵敏、准确的检测是有效防治本病、诊断病原菌和保证食品卫生安全的重要手段。
二、单增李斯特菌的检测方法
（1）平板培养法（国标）：用不同浓度的沙门菌菌悬液人工染菌二类食品各4o份，用增菌液两步增菌，两种分离培养基分离，对比检出率及分离效果。检出率62．5％，最低检出限为0.5cfu/25g一13cfu/25g。
（2）显色培养基：上海欢奥科贸有限公司
（3）PCR试剂盒：生物梅里埃的检测系统、杜邦：BAX®系统检测法，BAX®系统的单增李斯特菌检测法的灵敏度和特异性比率达到了98%，，并通过USDA-FSIS和AOAC国际的认证，成为官方检测法。
美国伯乐iQ-Check单增李斯特菌的检测：iQ-Check系统采用了所有的实时荧光PCR方法的优点为食品中病原微生物提供快速和可靠地检测解决方案。iQ-Check试剂盒为食品和环境样品中的单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)定性检测试剂盒。
陆桥：
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）荧光定量PCR检测试剂盒1680 48T
索奥：
单增李斯特菌(LM)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
（4）胶体金快速检测卡：无锡中德伯尔生物技术有限公司
（5）单增李斯特菌ELISA检测试剂盒：德国拜发（苏微有代理）
三、单增李斯特菌抗体的制备
（1）单增李斯特菌(Listeriamonocytogens)鸡卵黄抗体的制备
菌体抗原的制备动物免疫特异性IgY的提取，最好的用硫酸铵盐析法
（2）单核增生李斯特菌InternalinA的克隆表达与抗体制备
InternalinA是单核增生李斯特菌独有的表面蛋白,是参与病菌黏附入侵上皮细胞的主要因子。InlA是含有800个氨基酸的蛋白,它富含亮氨酸高度重复区域(LRR),LRRs内部的重复结构区对于InlA识别上皮细胞的黏附位点尤为关键,侵染时,可能是LRR区域直接与上皮细胞的E-钙粘蛋白作用。另外,InlA的C端存在的LPXTG保守模体使此蛋白与李斯特菌细胞表面的肽聚糖连接,故使InlA呈现于菌体的外表面。InlA作为单核增生李斯特菌的特征性抗原引起了国外学者的关注,制备其多克隆抗体,进行免疫学检测是研究的一个热点。目前国内尚没有相关的研究报道。
克隆表达单核增生李斯特菌InternalinA(InlA),并以之为抗原制备检测单核增生李斯特菌的抗体。通过PCR技术从单核细胞增生李斯特菌中扩增出inlA基因,克隆筛选和测序鉴定后,最终构建该基因的原核表达质粒pGEX-4T-InlA,谷胱甘肽树脂亲和层析纯化表达产物后,免疫小鼠分别制备相应的多抗和单抗。
（3）单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性研究及单克隆抗体的制备原核表达单增李斯特菌(Lm)ActA蛋白并进行亲合层析纯化,检测ActA的免疫原性,以表达蛋白为检测抗原制备Lm单克隆抗体,并对单抗的亚型、效价、亲合力及特异性进行测定。
（4）以纯化的单核细胞增生李斯特菌为抗原,免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。（胶体金标记单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备）
单克隆抗体的纯化：小鼠腹水可通过亲和层析方法获得所需的纯化单克隆抗体。
小鼠腹水可通过饱和硫酸铵盐析、D-SaltTM脱盐柱、IgM纯化试剂盒获得。
（5）以Lm为免疫抗原免疫Balb/c小鼠，待小鼠效价达到要求后，按照常规方法进行细胞融合，以纯化的ActA（肌动蛋白聚合蛋白）蛋白为检测抗原筛选杂交瘤细胞，采用有限稀释法进行克隆。
（6）建立胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法
该法可在10min内完成定性和半定量检测，定量检测灵敏度为3.5×103cfu/ml，线
性范围3.5×105-3.5×108cfu/ml，回收率在99%-101.7%之间。
单增李斯特菌P60多克隆抗体（Listeria monocytogenes,multiple cloning antibody ofP60由吉林出入境检验检疫局提供）、羊抗兔IgG（购自鼎国生物技术公司）。
