小G蛋白的特点 蛋白质的特点

小G蛋白，像G蛋白，尤其像G蛋白中的α亚基。所以我们的教材，把小G蛋白，与G蛋白一起介绍。

但是，G蛋白传递的信号，来自G蛋白偶联受体，往后，传递信号给效应器，比如腺苷酸环化酶（AC)。而小G蛋白传递的信号，来自膜上的“非酶表面受体”，比如IL-2受体；或者信号来自膜上的“受体酪氨酸激酶”。所以小G蛋白的信号通路，与G蛋白偶联受体的信号通路不同！

受体酪氨酸激酶（receptor tyrosinekinases，RTKs）包括6个亚族（见教材）。
信号转导：配体→受体→受体二聚化→受体的自磷酸化→激活RTK→胞内信号蛋白→启动信号传导
 RTK- Ras信号通路：
配体→活化酪氨酸激酶RTK→活化的酪氨酸激酶RTK 结合接头蛋白adaptor →GRF（鸟苷酸释放因子）促进GDP释放→Ras（GTP结合蛋白）活化，诱导下游事件：Raf丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（又称MAPKKK）活化（使蛋白上的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化）→活化的Raf结合并磷酸化另一种蛋白激酶MAPKK，导致MAPKK活化（MAPKK是一种具双重特异的蛋白激酶，它能磷酸化MAPK的苏氨酸和酪氨酸残基使之激活）→MAPK活化→进入细胞核→其它激酶或基因调控蛋白（转录因子）的磷酸化修饰。
MAPK（Mitogen-activated protein kinase）又称ERK（extracelularsignal-regulatedkinase）----真核细胞广泛存在的Ser/Thr蛋白激酶。有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)。
MAPK的底物：膜蛋白（受体、酶）、胞浆蛋白、核骨架蛋白、及多种核内或胞浆内的转录调控因子----在细胞增殖和分化中具有重要调控作用。
PTX敏感性G蛋白（Gi，Go）的亚基依赖于Ras激活MAPK，具体机制还有待深入研究；
PKC、PLC与G蛋白偶联受体介导的MAPK激活
PKC和PLC 参与G蛋白偶联受体激活MAPK ：
G蛋白偶联受体激活G蛋白； G蛋白α亚基或β、γ亚基激活PLC，促进膜磷脂代谢； 磷脂代谢产物（ DAG + IP3 ）激活PKC； PKC 通过Ras 或Raf 激活MAPK ；
由于PKC对钙的依赖性不同，所以G蛋白偶联受体– MAPK途径对钙要求不同；
 PKA对G蛋白偶联受体– MAPK途径的负调控
迄今未发现和制备出MAPK组成型突变（dominant negativemutant），提示细胞难于忍受MAPK的持续激活（MAPK的去活是细胞维持正常生长代谢所必须）。主要机制：特异性的Tyr/Thr磷脂酶可选择性地使MAPK去磷酸化，关闭MAPK信号。
 cAMP ， MAPK；cAMP直接激活cAMP依赖的PKA；PKA可能通过RTK或通过抑制Raf-Ras相互作用起负调控作用。
RTKs的失敏：
催化性受体的效应器位于受体本身，因此失敏即酶活性速发抑制。
机制：受体的磷酸化修饰。EGF受体Thr654的磷酸化导致RTK活性的抑制，如果该位点产生Ala突变，则阻止活性抑制，后又发现C端的Ser1046/7也是磷酸化位点。磷酸化位点所在的C端恰好是SH2结构域的结合部位。
引起受体磷酸化的激酶：
PKC----作用于Thr654；
CaMK 2（Ca2+和CaM依赖的激酶2）----作用于Ser1046/7
还发现：EGF受体是CDK的靶蛋白，提示和周期调控有关。
 RTK晶体结构研究表明，RTK激活后形成稳定的非抑制性构象；磷酸化修饰后，形成抑制性构象，引起失敏。
 RTK失敏对细胞正常功能所必须，RTK的持续激活将导致细胞生长失控。

小G蛋白（Small GProtein）因分子量只有20~30KD而得名，同样具有GTP酶活性，在多种细胞反应中具有开关作用。小G蛋白定义：单体形式的G蛋白。主要分布于胞质或质膜内侧，已发现有60多种。

第一个被发现的小G蛋白是Ras，它是ras基因的产物。其它的小G蛋白，还有Rho，SEC4，YPT1等，微管蛋白β亚基也是一种小G蛋白。

小G蛋白的共同特点是，当结合了GTP时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当GTP水解成为GDP时（自身为GTP酶）则回复到非活化状态。这一点与G蛋白里的Gα类似，但是小G蛋白的分子量明显低于Gα。

在细胞中存在着一些专门控制小G蛋白活性的小G蛋白调节因子，有的可以增强小G蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子（guaninenucleotide exchange factor, GEF）和鸟苷酸解离抑制因子（Guanine nucleotidedissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPaseactivating protein, GAP）。

近年来研究发现小G蛋白，特别是一些原癌基因表达产物，有着广泛的调节功能。Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导；Rho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用；Rab蛋白则参与调控细胞内膜交通（membranetraffic）。此外，Rho和Rab亚家庭可能分别参与淋巴细胞极化（polarization）和抗原的提呈。

某些信号蛋白通过SH-3结构域，将酪氨酸激酶途径同一些由小G蛋白所控制的途径连接起来，如Rho（与Ras有30%同源性）调节胞浆中微丝上肌动蛋白的聚合或解离，从而影响细胞形态。这一事实解释了某些含有SH-3的蛋白同细胞骨架某些成份相关联或调节它们的功能。

这是细胞内存在的另一类G蛋白，这类G蛋白具有鸟核苷酸的结合位点，有GTP酶活性，其功能也受鸟核苷酸调节，但与跨膜信息传递似乎没有直接相关。在结构上不同于前述的G蛋白，分子量较小，在20-30kDa之间，不是以α、β、γ三聚体方式存在，而是单体分子，因此被称为小G蛋白（smallG proteins）。ras表达产物为一种小G蛋白。小G蛋白同ras蛋白具有同源性，同属于ras超家族（rassuperfamily）。哺乳动物G蛋白中属ras超家族约有50多个成员，根据它们序列同源性相近程度又可以分为Ras、Rho和Rab三个主要的亚家族。

Ras超家族主要有Ras、Rho、Rab、Arf以及Ran (Ras-related nuclearprotein)家族。哺乳类RaS家族包括Ras(Ha一Ras，Ki一Ras，N一Ras)、RaP(RaPIA，RaPIB，RaPZA，RaPZB，RaPZC)、Ral(Rall，RalZ)、R一Ras(R一Ras，R一RasZ/TCZI，R一Ras3/M一Ras)、Rhe、Rin和Rit。

Rap2与Rap1同属于Ras超家族，小分子量GTP结合蛋白的Rap亚家族,Rap2的氨基酸序列与Rap1具有60%的同源性,推测二者可能具有相似的信号途径和相近的生物学功能,包括细胞的增殖、分化、粘附和细胞骨架重排。然而,Rap2位于效应因子结构域的第39位的苯丙氨酸不同于Rap1及Ras的丝氨酸,这个关键差异表明其可能通过特异的下游信号分子调控独特的生物学功能。随着Rap2特异效应因子的不断发现,Rap2特异的信号通路及功能受到了更多的关注,Rap2具有多样的生物学功能,除调控细胞粘附及细胞骨架动态组装外、Rap2调节中枢神经突触的可塑性以及非洲爪蟾发育中背腹轴特化。此外,也有报道显示Rap2的表达增强与多种肿瘤的形成具有相关性。

小G蛋白ARL家族成员ARL2参与细胞内微管组装的调控。此外，ARL2通过与效应蛋白BART的结合，维持STAT3在细胞核内的定位，并参与线粒体ATP/ADP通道的调控。丁建平课题组博士生张天龙等运用结构生物学的方法解析了ARL2-GTP-BART复合物的晶体结构，发现ARL2以一种新的方式识别和结合BART，并进一步运用生物化学和分子生物学方法对ARL2-BART之间的相互作用进行了验证。目前发现的ARL家族其他成员通过开关区域与效应蛋白相互作用，其N端α螺旋通过脂酰修饰定位在高尔基体膜上、不参与效应蛋白的结合。而ARL2除了通过其开关区域识别BART外，还利用N端α螺旋识别和结合BART表面的一疏水口袋，以增强对效应蛋白的特异性识别和结合、从而精确调控下游信号通路。这种作用方式在小G蛋白与效应蛋白相互作用研究中是首次被发现。这一研究成果对进一步研究ARL家族成员的结构与功能的关系，阐释ARL家族成员之间、以及与其它小G蛋白的功能差异的分子基础具有重要意义。

Ras (Ratsarcoma) 蛋白，Harrey 和 Kirfen鼠肉瘤病毒的蛋白称H-ras，K-ras，人神经母细胞瘤上发现N-ras。

Ras蛋白是一种小G蛋白，RAS信号途径是一种很常见的细胞分子信号传导途径。

受体酪氨酸激酶（RPTK）结合信号分子，形成二聚体，并发生自磷酸化而活化，活化的RPTK激活RAS，由活化的RAS引起蛋白激酶的磷酸化级联反应。

Ras本身的GTP酶活性不强，需要GTP酶活化蛋白（GAP）的参与，使Ras结合的GTP水解而失活，GAP具有SH2结构域可直接与活化的受体结合。

Ras蛋白与Raf的N端结构域结合并使其激活，Raf是丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶（又称MAPKKK）

活化的Raf结合并磷酸化另一种蛋白激酶MAPKK，使其活化。

MAPKK又使MAPK的苏氨酸和酪氨酸残基使之激活。

MAPK为有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK），属丝氨酸/苏氨酸残激酶。活化的MAPK进入细胞核，可使许多转录因子活化，如将Elk-1激活，促进c-fos，c-jun的表达。

RPTK-Ras信号通路可概括如下：

配体→RPTK→adaptor→GEF→Ras→Raf（MAPKKK）→MAPKK→MAPK→进入细胞核→转录因子→基因表达。

Ras最常见的是Ras的激活型突变。Ras蛋白要释放GDP，结合GTP的才能激活，GDP的释放需要鸟苷酸交换因子（GEF，如Sos）参与；Sos有SH3结构域，但没有SH2结构域，因此不能直接和受体结合，需要接头蛋白（如Grb2）的连接，接头蛋白通过SH2与受体的磷酸酪氨酸残基结合，再通过SH3与Sos结合，Sos与膜上的Ras接触，从而活化Ras。在肿瘤中最常发现的Ras突变是第十二位甘氨酸，十三位甘氨酸或六十一位谷氨酰胺为其他氨基酸残基所取代。导致Ras自身的GTP酶活性下降，使得RasGTP不能变成RasGDP，而始终处于GTP结合的状态，造成Ras-Raf-MEK-ERK通路过度激活，从而导致细胞的过度增殖与肿瘤的发生。

研究表明，ras基因编码的Ras蛋白不仅直接参与细胞内的信号转导途径，而且影响到其他细胞信号转导途径，是信号转导的重要组织者。

1激活蛋白激酶MAPK通路

ras基因编码的小GTP结合蛋白―Ras，是调节细胞生长的重要转导蛋白，有两种翻译后修饰方式：一是Ras的C端CAAX模体半胱氨酸的法尼基化（15碳的异戊二烯基），Ras在胞质中法尼基化后结合到内质网，如酵母菌和哺乳动物，内质网具有多种酶催化水解AAX残基，然后C端羧基甲基化，CAAX模体的修饰使RasC端具有疏水性。二是N/HRas的半胱氨酸的S酰基化，长链的S酰基取代基使Ras具有疏水性。这两种方式都促使Ras锚定细胞膜上，以N乙酰S顺-法尼基半胱氨酸抑制羧基甲酰基转移酶，则可抑制Ras锚定 于细胞膜。

细胞膜是Ras与上游衔接蛋白和鸟苷酸交换因子作用的部位，也是与下游底物作用部位。

Raf1是分子量为70~74KD的丝/苏氨酸蛋白激酶，RasGTP在胞外不能激活Raf1，在胞内与Raf1的氨基端作用，介导Raf1锚定细胞膜与胞质层作用，暴露其激酶活性而被激活。Leevers等在Raf1羧基端增加Ras的CAAX模体和富碱区，形成嵌合蛋白Raf的CAAX，则可不依赖Ras而锚定于细胞膜并激活。

Ras和Raf1的结合区位于Raf1的Ras结合区（51~131氨基酸残基）与Ras的效应功能区（32~40氨基酸残基）、Raf1的富含半胱氨酸区与Ras的激活区（26~31）和41~48氨基酸残基，Ras31位谷氨酸被替换则影响Ras和Raf1的结合以及Raf1的激活。

Raf1为MAPK激酶（MAPKK）激酶，其活性位于羧基端，Raf1磷酸化并活化MAPKK。MAPKK在哺乳动物细胞中有多种异构体，起活性调节包括上游的Raf家族和MAPKK激酶，MAPKK通过双位点的丝/苏氨酸和酪氨酸磷酸化，MAPK使之活化，活化的MAPK可被双位点任一残基去磷酸化而失活，MAPK通路在细胞应答各种细胞外信号过程中发挥重要作用。参与细胞的增殖和分化压力应答和发动凋亡。细胞因子诱导Raf1磷酸化活化激活MAPK激酶1/2然后磷酸化。MAPK1/2催化域活性袢内的丝/苏氨酸基序。Ge等发现MAPK与无催化活性的脚架蛋白的转化因子活化蛋白激酶/结合蛋白1（TAB1）结合，引起自磷酸化激活TAK1-TAB1-TAB2复合物，通过TRAF6参与调节核转导因子NFκB。

2NFκB信号通路

NFκB是可诱导和广泛表达的转录因子，活化NFκB复合物是Rel多肽家族的不同形式二聚体组合，包括p50(NFκB1)、p52(NFκB2)、CRel、VRel、Rel(ALPG)和RelB。NFκB抑制子蛋白有3种异构体，其中IKBα为强的负反馈调节因子，使NFκB应答快速关闭，而IKBβ和IKBα功能是降低系统的摆动能力和稳定NFκB对长期刺激的应答。

NFκB参与肿瘤发生的机制有以下两种方式：一是通过调节血管内皮生长因子和IL8，参与肿瘤侵袭性和血管形成通过，诱导趋化因子受体CXCR4促进乳腺癌细胞转移。Ras具有诱导细胞调亡的作用，而NFκB可以抑制这一作用，从而促进肿瘤生长，如Mayo等发现阻断NFκB信号能抑制裸鼠腹腔接种的人卵巢细胞血管形成，为此提供了证据。二是通过激活抗凋亡蛋白基因如BclXL和细胞凋亡抑制因子阻断凋亡，诱导肿瘤耐药，目前临床上常用的许多药物多是针对NFκB抑制Ras诱导细胞调亡机制发挥作用，如诱导胰腺癌对健择耐药和Ras触发细胞生长周期阻滞，NFκB及Ras表达抑制皮肤增殖等。

3转化生长因子β（TGFβ）信号通路

TGFβ信号通过细胞表面的丝/苏氨酸受体TβR，传输到特殊的细胞内递质Smad蛋白，在正常细胞中起抑制细胞增殖作用。Kim发现TGFβ触发Elf(Ers家族成员)磷酸化与Smad3和Smad4结合。mElf3在激活mTβRⅡ启动子中起重要作用。Smad蛋白激活后移位入细胞核活化基因表达，在生长分化、血管重塑和细胞特化中起重要作用。

通路中TGFβ受体Ⅰ、Ⅱ、Smad2、Smad4功能失活引起TGF13生长，抑制应答功能丧失，在肿瘤形成中起重要作用，TGFβ的作用还受到MEK/Erk/SKP2的影响。TGFβ被认为是前列腺癌形成的致瘤开关，TGFβ的作用可以通过多种途径发挥，其中就包括ras信号转导途径，比如Park等发现TGFβ激活RasRafMAPK级联并参与AP1依赖方式诱导IL-6生成致瘤。

迄今为止的研究从不同层次为ras作用的细胞信号转导途径进行了探讨。虽已有一些进展，但有许多问题尚未解决。由于Ras为致癌基因，其细胞信号传导途径的进一步探讨，将有助于人们以后针对ras基因相关的肿瘤治疗的研究。

Ras-MAPK信号转导途径
　　1 Ras上游通路
　　Ras能被复杂的网络激活.首先,被磷酸化激活的受体如PDGFR,EGFR直接结合生长因子受体结合蛋白(Grb2),
这些受体也可以间接结合并磷酸化含有src同源区2(SH2)结构域的蛋白质(例如Shc,Syp)后,再激活Grb2.第二,　Grb2的src同源区3(SH3)结构域与靶蛋白如mSos1,mSos2,C3G及发动蛋白(dynamin)结合.C3G与连接蛋白Crk的SH3结构域结合后耦联酪氨酸磷酸化而激活Ras.
　　Crk也能结合mSos1激活Ras.Grb2与激活的受体结合促进鸟苷酸交换因子(Sos)蛋白定位在与Ras相邻的细胞膜上.这样,Sos与Ras形成复合体,GTP取代GDP与Ras结合后,Ras被激活,当GTP水解成GDP后Ras失活.Ras具有内在GTPase活性,它的活性可被RasGAPs调节,因而RasGAPs扮演Ras活性调节剂的角色.另外,Ras失活也受到高度调节.目前,有三种蛋白质能水解GTP使Ras失活,它们分别是P120GAP,neuro fibromin和GAP1m,统称为Ras GAPs.
　　2 Ras下游通路

　　2.1 Ras/Raf通路

至今,Ras/Raf通路是最明确的信号转导通路.当GTP取代GDP与Ras结合,Ras被激活后,再激活丝苏氨酸激酶级联放大效应,招集细胞浆内Raf1丝/苏氨酸激酶至细胞膜上,Raf激酶磷酸化MAPK激酶(MAPKK),MAPKK激活MAPK.MAPK被激活后,转至细胞核内,直接激活转录因子.另外,MAPK刺激Fos,Jun转录因子形成转录因子AP1,该因子与myc基因旁的特异的DNA序列结合,从而启动转录.

myc基因产物也是转录因子,它能激活其他基因.最终,这些信号集中起来诱导D型Cyclin的表达和活性.D型Cyclin与Cyclin依赖性激酶(如CDK4和CDK6)形成复合体,该复合体的形成促使细胞从G1期进入S期.因此,Ras/Raf通路在受体信号和G1期进展之间起着关键作用.

然而,Ras/Raf通路不是调控G1期进展的惟一通路.Ras与Raf单独结合不能促进Raf激酶活性,同时,Raf能被不依赖Ras的机制所激活(例如能被Src酪氨酸激酶和PKC所激活),MAPK也能被不依赖Ras机制(如通过调节整合素的活性)所激活.表明级联反应每一个信号蛋白质都能被多个上游蛋白质所激活,而它们也可能有另外的靶蛋白.

另一个重要的Ras通路效应物是Cyclin依赖性激酶抑制剂P21 Waf1/cip1,它被Ras所诱导,抑制Cdk-CyclinE和Cdk-Cyclin A复合体的活性,从而阻断DNA的合成.
　　2.2 Rho/Rac通路

Rho家族蛋白质是小G蛋白的Ras超家族成员,其氨基酸序列大约有30%与Ras蛋白相同,三个主要的Rho蛋白是Cdc42,Rho,Rac.Cdc42刺激Rac,Rac接下来刺激Rho.然而,这个直线模型对于精确的信号
　　转导通路来说过于简单,因为有证据显示交叉联系存在,例如Cdc42不通过Rac能影响Rho的活性.下游靶点Rho激酶α的激活,导致肌动蛋白的重新构建和P21激活的丝苏氨基酸激酶参与应力纤维的分解.最后Rac和Cdc42利用　MAPK传递信号至核内,Rho通过刺激Src和fos启动子达到转录调节的作用.另外,Rac和Cdc42激活JunN端激酶,该酶结合Jun,EIk1和ATF2等转录因子,这就是Rho在细胞癌变过程中起重要作用的可能机制.另一个重要Rho下游靶点是P21Waf1/cip1.Rho抑制P21Waf1/cip1诱导,有利于Ras驱动细胞进入S期,P21Waf1/cip1阴性细胞不需要Rho进行Ras激活的DNA合成,降低了通过诱导P21Waf1/cip1在Ras转化过程中的重要性.

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