HPLC定量测定:绝对校正因子:检测量W与色谱响应值(峰面积等)A之间的比值;相对校正因子(通常所讲的校正因子):物质i与参照物质s的绝对校正因子之比。
加校正因子的主成分自身对照法:优点:考虑了杂质与主成分绝对校正因子的差异所引起的测定误差, 不需长期提供标准物质。缺点:不同仪器及色谱条件可产生误差,需充分的方法耐用性验证,并结合色谱峰定位控制等将误差控制在一定范围内。
校正因子的测定:重要影响因素:标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等。
特定杂质及主成分的标准物质应具备量值准确的特点,符合标准物质(对照品)要求;确定校正因子的分析方法应与最终质量标准一致,色谱条件等变更时考虑对校正因子的影响,必要时重新确定;关注影响待测物UV吸收的各种因素:溶液制备的溶剂与最终确定的流动相相同,检测波长在特定杂质及主成分UV曲线的峰/谷处(避开吸收值急剧变化波段,保证测定方法的耐用性和测定结果的恒定)。
校正因子的确定:1.单浓度点测定。2.多浓度点测定:高、中、低浓度(涵盖定量限、标准限度),计算RSD,求平均值。3.标准曲线法测定:杂质对照品和主成分对照品分别制备系列溶液(涵盖定量限、标准限度),分别进样后按最小二乘法以进样量对响应值作线性回归求得两条标准曲线,两曲线斜率之比为校正因子。4.吸收系数比值法(UV检测器):测定检测波长处的紫外吸收系数E1cm1%之比。技术要求:对照品级别的标准物质、三浓度测定、吸收度介于0.3-0.8之间、至少5台不同型号的UV分光光度计、2份供试液同时平行制备测定、同仪器2份供试液的平行测定结果相差≤±0.5%等。1和2法较简捷,多用于评估采用主成分自身对照法时是否需校正。用加校正因子的主成分自身对照法定量杂质时更适合用3和4法。
校正因子的应用:为0.9-1.1时可不校正;超出该范围时,若采用主成分自身对照法定量,须加校正因子;<0.2或>5.0表明杂质与主成分的UV吸收相差过大,应调整检测波长等检测条件使校正因子位于上述范围内,或用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质重新确立校正因子;若校正因子仍无法调节至适当范围,用杂质对照品外标法等适当方式定量。应用前提:相同检测波长、分析方法、色谱条件等。色谱峰的保留时间要相对恒定,质量标准对特定杂质的色谱峰需规定RRT。
申报资料常见问题:1.特定杂质采用主成分自身对照法定量时未研究校正因子及对比结果校正前后的数据;2.校正因子超过指导原则中不需校正的范围,仍采用不加校正因子的主成分自身对照法;3.校正因子不能有效校正测定结果,在无充分数据支持的情况下仍采用加校正因子的主成分自身对照法。
特定杂质的控制建议:测定校正因子,对比研究几种方法(包括杂质对照品外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法)对相同多批样品杂质定量测定的结果,作为是否需校正或能否有效校正的依据。校正因子若需载入质量标准应由省所协作标定或进行针对性技术复核。
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