爱华网犬瘟热介绍
（北京康乐佳宠物医院王建宇）
犬瘟热(Canine Distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)感染引起的急性、高度接触性传染病，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，病死率30%-80%，雪貂高达100%
1 病原学
早在1905年，Carre就提出本病的病原是一种病毒。1951年Dedie首次用组织培养的方法培养出了CDV。在我国70年代末，华国荫等先后从进口的CDV弱毒疫苗株中分离出多种疫苗株。现已查明犬瘟热病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属，被列为该属的病毒还有麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、小反当兽瘟疫(PPRV),海豹瘟热病毒((PDV )、海豚瘟热病毒(DDV ),鼠海豚瘟热病毒(PMV);它与MV,RPV之间有密切的抗原关系和共同特性，并与MV, RPV超微形态和结构完全一样，而且与新城疫及其他副粘病毒非常相似aCDV呈圆形或不规则形，有时呈长丝状，直径100-300nm不等，大小差异较大。基因组为负链线性RNA病毒，基因组长约16kboCDV的核衣壳由基因组与蛋白N组成，呈螺旋状盘曲在病毒粒子的中央，外面覆有一近似双层轮廓的脂质囊膜，膜上密布1.3nm杆状纤突，纤突只含血凝素，而无神经氨酸。应用单克隆抗体研究发现，不同来源的CDV毒株虽然在细胞蚀斑、鸡胚痘斑形成方面、对乳鼠的神经毒力方面有明显不同，但在结构蛋白和核酸电泳图谱方面却相差甚微，故仍属于同一个血清型CDV对热、干燥、紫外线和有机溶剂敏感，易被日光、酒精、乙醚、甲醛与煤酚皂等杀死。2-4℃可存活数周，室温数天，50600C1h即可使病毒灭活。pH4.5以下和9.0以上的酸碱环境也可使其迅速灭活。但在低温冻结时可保存几个月，冷冻干燥可保存数年。CDV可在来源于犬、貂、猴、鸡和人的多种原代和传代细胞上生长，但初次培
养比较困难。实验感染也可使鸡胚、雪貂、乳鼠、犬发病，其中以雪貂最为易感，为公认的CDV实验动物。
2 流行病学
在自然条件下，CDV可感染犬;己有研究发现，犬瘟热病毒还可感染犬科的其它动物如狐、狼，触科、烷熊科、猫科(如狮、虎、豹)等多种动物。近年来其感染的范围不断扩大，已经延伸至西湍、日本称猴和人Mee等还从患PAGRTS疾病的病人组织中检测出CDV核酸。近来试验表明，CDV可感染人宫颈癌细胞系，在培养的Vero,B95a等灵长类细胞系中也可增殖，并表达一种跨膜蛋白(CD9),CD9使细胞对病毒易感，被认为CDV的细胞受体。这使得CDV可能成为由动物感染人的第二种疫病。犬瘟热病毒是一种传染性极强的病原体，在易感的犬和水貂中很容易传播，主要的传染源和病毒宿主就是犬和水貂，其次是其它患CD的动物和带毒动物。病毒存在于肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等多种器官与组织中，通过眼泪、鼻涕、唾液、尿液和呼出的空气向外排出病毒。病毒在带毒犬体中的持续时间很长，甚至可以感染下一代的幼犬。本病的传播可能通过直接接触，或近距离的飞沫传播，因此在同一所建筑物里的动物大多受到感染。侵入途径为扁桃体以及其他的淋巴组织、呼吸道上皮和眼结膜。雪貂经鼻接种后48小时，应用荧光抗体技术可在颈部淋巴结内检出特异性病毒抗原。病毒首先在内皮细胞的胞浆内出现，呈现细小的荧光颗粒，但在感染后期，这些颗粒凝集成大的卵圆形结构，类似胞浆内包涵体，于实验感染后第4天，可自血液、纵隔和肠系膜淋巴结、脾脏中检出病毒。病毒在这些部位常可持续9-12天，再经9天左右，充满病毒的单核细胞能在全身各部位找到。在不能产生有效抗体的犬体中，感染继续发展，广泛侵入上皮细胞。这些上皮细胞遭到损伤的结果，病兽表现特异性临床症状，如食欲不振、腹泻、结膜炎和痉挛等。将病毒直接注入胃内，动物不感染，而且继续保持对犬瘟热的高度敏感。CD康复犬可获得终生免疫力。犬感染CD具有明显的年龄、品种和季节性，而且似有2-3年流行一次的周期性。断奶至1岁的幼犬多发，老龄犬和哺乳仔犬发病极少，可能是由于CD可产生获得性主动免疫和母源被动免疫。发病的和轻度感染的犬，不但可产生很强的主动免疫力，而且可以通过胎盘和初乳将此免疫力被动地传递给新生仔犬，结果使犬群的易感性大为降低。纯种犬与本地土种犬相比易感性明显提高。本病在寒冷的季节(10月至来年4月)多发。但由于近年来，养犬业的迅速发展，犬的频繁交流和调运，以致犬群的免疫水平动荡不定，发病周期也不在明显。CD也是对我国的毛皮动物养殖业危害最大的传染病之一CD流行时，貉最先发病，然后是狐，其中北极狐要比银黑狐和彩狐易感。流行季节一般在8-10月份，呈散发、地方流行和爆发。流行规律为，未免疫的种兽所生仔兽断乳前发病率较高，经免疫种兽所生仔兽在哺乳期间和断乳后15天前很少感染CD，断乳15天-20天后发病率最高，易暴发流行。流行过程中老兽很少发病，仅出现于流行的中后期，一般死亡率为2%-5%。目前，CD的流行约70%为典型经过，30%属于非典型经过，神经型CD的貉和狐较少见。在引种、串种和倒种的过程中常易发生CD的流行。如不采取有效措施，易造成地方大规模流行，后果甚为严重。
3 临床症状和病理学
CD的潜伏期随动物机体的免疫力和所感染病毒的毒力和数量而不同。一般本病的潜伏期约为3-6天，多数动物于感染后的第4天体温升高，少数第5天，极少数第3天或第6天。若野毒株来源于异种动物，由于需要一段适应时间，潜伏期可拉长至3060天．CDV是一种泛嗜性病毒，可感染多种细胞和组织，但亲嗜性最强的是淋巴细胞和上皮细胞。在感染动物机体后，CDV经2-4天增殖，形成病毒血症，机体的细胞免疫和体液免疫功能受到严重破坏，可引起机体发生细菌性感染，从而可产生体温升高等临床症状。本病的典型临床症状按病程发展表现“双相型”发热(体温两次升高)，眼、鼻有卡他性或化脓性分泌物，在第二次发热时表现呕吐和腹泻，呼吸道有卡他性炎症，有时发展成肺炎;发展到后期有时会出现神经症状，如肌肉痉挛或后肢瘫痪，可能持续很长时间，少数病犬可见腹部脓性皮疹及足垫角质化过度，死亡率变化不定一，在无并发症的情况下，通常很少死亡，并发症如肺炎和脑炎，约占所有病例的50%，这些病例的死亡率高达70%-80%。在原来没有犬瘟热的地区内。首次爆发犬瘟热时，动物易感性极高，死亡率高达90%，甚至更高。CD是一种泛嗜性感染，病变分布广泛。病理变化随病程长短、临床症状和继发感染的种类与程度不同而异。早期尚未继发细菌感染的病犬，仅见胸腺萎缩和胶样浸润，脾脏、扁桃体等脏器中的淋巴细胞减少。发生细菌继发感染的病犬，则可见化脓性鼻炎、结膜炎、支气管肺炎或化脓性肺炎。消化道则可见卡他性乃至出血性肠炎。死于神经症状的病犬，眼观仅见脑膜充血，脑室扩张及脑脊液增多等非特异性脑炎变化。另外病犬还可见膀肤豁膜下淤血、出血与水肿。对病犬进行组织学检查可以发现，在很多组织细胞中有泛嗜性的核内和胞浆内包涵体，成圆形或椭圆形，直径1-211m。胞浆内包涵体主要见于泌尿道、膀肤、呼吸系统、胆管、大小肠砧膜上皮细胞内及肾上腺髓质、淋巴结、扁桃体和脾脏的某些细胞中;核内包涵体主要见于膀肤细胞，一般很难查到。表现神经症状的病犬，可见有脑血栓袖套细胞，非化脓性软脑膜炎以及白质出现空泡，很多Purkinje细胞变性以及小脑神经胶质瘤病。
4 诊断学
根据流行病学资料及临床症状，如双相热型、粘膜卡他、中枢神经症状及足垫角化过度等主要症状，可以做出初步诊断。确诊需要依据实验室检验。
4.1包涵体检查
生前自鼻、舌、结膜等部位刮取病料，死后则刮取膀肤、肾盂、胆囊和胆管等处粘膜，做成涂片，干燥，甲醇固定，苏木紫和伊红染色，镜检。也可将犬脑或膀肤作常规的石蜡切片，H.E染色，观察。包涵体成红色，直径1-gum，圆形或椭圆形，边缘清楚，多见于胞浆内，少见于核内。但由于与狂犬病病毒、犬传染性肝炎病毒等形成的包涵体及细胞本身某些反应产物难以区分，需与其他方法结合才能做出诊断。
4.2病毒分离与鉴定
(1)病毒的分离:因CDV的分离率较低，对急性病例，应采取血(淋巴细胞)，亚急性者可取含毒较多的内脏组织(例肝脏、脾脏、肺脏、淋巴结等)，慢性或出现神经症状者可取脑组织，制成1:10的悬液，接种敏感细胞。而选择合适培养的细胞是分离成功的关键所在。据报道可用于分离培养CDV的原代细胞有犬和豹的肺巨噬细胞、胚胎细胞、’肾细胞、犊牛的肾细胞、牛胚胎肺细胞、鸡胚成纤维细胞、外周血淋巴细胞等，其中以肺巨噬细胞为最常用，分离率较高。而传代细胞包括人宫颈癌细胞系(Hela)、兔肾细胞系(RK13)、猫肾细胞系(CrFK)、犬肾细胞系(MDCK)、细胞系(B95a)、猫胚胎细胞系(FE)、乳仓鼠肾细胞系(BHK21)、转化牛成T细胞系、非洲绿猴肾细胞系(Vero)及其克隆株(VeroE6);传代细胞易得，使用频率较高，缺点是传代不易稳定，容易发生毒力降低或细胞病变现象。CDV一旦适应某一细胞后，即易在其它细胞上生长，其中以犬肺巨噬细胞最为敏感，可形成葡萄串状的典型细胞病变，鸡胚成纤维细胞应用的最多，即可形成星芒状和露珠状的细胞病变，也可在覆盖的琼脂下形成微小的蚀斑，但肺巨噬细胞制备困难，易污染。Rockborn发现CDV在原代犬肾细胞上能形成合胞体、星状细胞与核内或胞浆内包涵体。江国托(1995)报道利用鸡胚成纤维细胞培养出较高滴度的CDV，细胞病变极其出现的时间较稳定，接种细胞后48h即可出现明显的融合细胞病变，60h细胞拉网，72h大量细胞脱落。
(2)病毒的鉴定:对分离出的病毒进行常规的鉴定，包括核酸型、囊膜试验，以及电镜观察CDV大小形态和CDV在细胞中的分布情况。若病料中分离不出CDV，也可通过对CDV特异性抗原或发病动物血清中特异性抗体的检测做出诊断，其中检测特异性抗体进行诊断的前提条件是发病动物没有疫苗接种史。这些方法包括琼脂扩散沉淀试验、EL工SA和中和试验、荧光抗体技术以及其他免疫组化技术。虽然上述方法取得了一定的效果，但有的耗时较长，有的敏感性、特异性或准确性较差，不能及时确诊。近年来随着PCR、核酸探针、原位杂交和基因序列分析等技术的广泛应用，CDV的诊断进入了分子生物学阶段。核酸探针、原位杂交、RT-PCR以及基因序列分析等方法建立之后，就可对病料中是否含有CDV特异性核酸进行鉴定，从而提高了犬瘟热诊断的准确性、敏感性和特异性。国外Zurbrigge。等〔187用地高辛标记N基因互补的特异性RNA探针具有高度敏感性，可查证单个感染细胞中存在的目的核酸序列，特异性较强，不产生背景，福尔马林固定的脑组织切片及培养细胞的结构保持良好。ShinY等〔1s,20〕运用RT-PCR检测出病料中CDV核衣壳蛋白基因N及运用pRVSV载体成功表达了CDV的N基因。我国李金中等(1995)建立RT-PCR诊断方法，用于临床诊断，检出阳性即可确诊，与电镜检查结果符合率高。这些方法敏感、特异性好，不仅可以用于CDV的诊断，还可以用于CDV的核酸序列测定，分析不同毒株在分子水平上的差异。
5 CDV抗原蛋白的研究
CDV颗粒由血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)、核衣壳蛋白(N或NP),磷蛋白(P)和膜蛋白(M)6种结构蛋白和1个C一非结构蛋白组成[211。分子量分别为H: 77kDa, F(前体):59 kDa (F,:41 kDa，F2:26 kDa), L: 180 kDa,N: 60 kDa, P: 73 kDa, C: 15 kDa;6个非重叠基因组区的编码基因按3’一5'端顺序依次为N-P-M-F-H-L系列，其长度分别为N 1683nt, P 1655 nt,M 1422 nt,F2205 nt, H 1947 nt, L 6573 nt P, N,L为髓芯蛋白，与RNA转录和复制有关;N蛋白是保守性较强的免疫源性蛋白，具有包裹和保护内部基因的功能，与病毒感染相关，是麻疹病毒属中主要的交叉抗原;P蛋白可能有聚合酶功能。H为包被蛋白，位于N蛋白的外侧。M蛋白为非糖基化表面蛋白，与病毒成熟和引起慢性持续性感染有关;H蛋白决定了CDV的宿主特异性，并协助F蛋白使病毒以囊膜与宿主细胞发生融合的方式进入宿主细胞，它也是产生中和抗体的主要抗原之一;CDV的H蛋白与麻疹病毒((MV)的H蛋白相似，但没有血凝作用，CDVH蛋白有广泛的糖基化位点，糖基化位点未被蛋白酶剪切。在麻疹病毒属所有的结构蛋白中，H蛋白基因变异大，抗原变化最高。野毒株与疫苗株病毒H蛋白的潜在糖基化位点不同。野毒株有8-9个糖基化位点，而Convac和Onderstepoot株分别为7和4个，糖基化的不同可能影响病毒的抗原性。此外，H蛋白还与细胞的嗜性相关;F蛋白(也叫融合蛋白)属于病毒表面的糖蛋白，介导病毒与感染细胞，感染细胞与非感染细胞的融合，使病毒具有在宿主体内扩散的能力。F和H都是产生中和抗体的主要抗原之一，在病毒免疫中占有重要地位，F所产生的保护率高于H。很多学者对F蛋白的研究较多，证明病毒中和抗原决定簇依赖于F，及FZ亚单位通过2个Arg之肤键相连形成的立体空间构象;在F，的N末端有一个长的疏水氨基酸片段，具有融合活性，称之融合序列。融合序列在麻疹病毒属中是相当保守的，其病毒组间出现的交叉保护现象可能与该序列有关。C蛋白为非结构蛋白，含174个氨基酸，序列保守，功能不明。目前，人们正在应用分子生物学技术对CDV进行研究。李金中等应用套式PCR分段扩增CDV融合蛋白的全基因，发现CDV外面囊膜区的融合蛋白(F)可分为3个主要功能区，即融合区、附着区和穿膜区，从而为融合蛋白各段功能的研究奠定了基础。Cherpillod等(1999)在分子水平上对CDV野株A75/17和疫苗株Ondestepoort的H和F蛋白的表达区进行分离和序列分析，结果表明CDV野株A75/17和疫苗株Ondestepoort的H蛋白表达区有139个不同的核普酸，这些核昔酸的变化导致两个毒株有57个不同的核营酸，这些核昔酸均匀分布在整个蛋白上。Messling (2001)等将野毒分离株5804Han89和疫苗株Ondestepoort的F,H蛋白进行组合感染Vero细胞观察融合效应，结果发现H和F蛋白不同组合的细胞融合效应程度主要取决于H蛋白。Yoshida等(1999)研究证实N蛋白1-80aa或337-358aa是CDV诱导产生抗体必不可少的抗原表位。由于CDV的种间传播(宿主不同)、病毒的不断变异和不同地域来源，病毒的生物学特性有差异，学者们推测CDV的基因具有多样性。他们证明当前流行的野毒株与标准的Lederle,Convac, Rockborn,Onderspoort等疫苗株的抗原性、CPE类型、毒力等生物学特性都不同;中国的CDV野外分离株与日本、北美洲、西伯利亚和欧洲的野外株都不相同，也均不同于标准的疫苗株[[351。李金中等通过对大熊猫CDV融合蛋白基因3’端的序列进行测定，分析了所测定病毒株与其它己知序列毒株之间的关系，发现毒株之间在核昔酸和氨基酸水平上的亲源关系不同。何洪彬等还通过对CDV株H蛋白基因的序列分析，发现间存在差异。这些不同是否对LU株H蛋白及其基因与疫苗弱毒Onderspoort野毒株之CDV的变异、致病性和抗原性等产生影响，还有待于进一步研究。
6 目的和意义
犬瘟热是由犬瘟热病毒感染引起的一种高度接触性传染病，是当前对宠物饲养业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。犬瘟热的扩散引起了从事疾病防治和研究的国内外专家学者的高度重视，并对犬瘟热病毒的分离培养、理化特性、流行病学、分子生物学、诊断及免疫与防疫等进行深入研究。自90年代以来，犬瘟热在四川的流行逐渐呈上升趋势，但国内对四川地方流行株的深入研究报道较少。因此展开犬瘟热四川地方流行株的研究非常必要。本研究是在对当前四川部分地区流行的犬瘟热进行病毒分离鉴定，并建立RTPCR的诊断方法，旨在研究四川地区不同来源的分离株在生物学特性、蛋白成份组成的差异，并寻求快速方便的诊断方法，这将对我国CDV的毒株鉴定、疫苗研制、临床诊断方法的研究均具有十分重要的理论意义和实际应用意义。
