表面等离子体共振 几何光学的基本定律

表面等离子体共振(SPR)

做生物分子相互作用测定,比较新的方法是OWLS和SPR。

表面等离子体子共振(surface plasmonresonance,SPR)是一种物理光学现象[1]。光在玻璃界面处发生全内反射时的倏逝波,可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子波。在入射角或波长为某一适当值的条件下,表面等离子波与倏逝波的频率和波数相等,二者将发生共振,入射光被吸收,使反射光能量急剧下降,在反射光谱上出现共振峰(即反射强度最低值)。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时,共振峰位置将不同。

自1983年Liedberg[2]将其用于检测抗原体反应后,SPR以其具有的实时,原位及无损检测等优于其他生物检测技术的优势,引起了人们越来越浓的兴趣。现在已经有一些商用仪器投入科研与医药事业中。其中最为著名的是BIACORE系列产品。

这些系统是在瑞典林平彻大学Liedberg等人的研究基础上,研制出可以用于基因序列分析、食品检测抗原抗体分析等方面的生化仪器,都是基于Kretschmann结构,采用专门的SPR系统和独立的微机相配合,软件控制液体流量、数据记录及SPR谱的分析,系统实时监测,可以连续数日工作,自动完成分析过程。但是价格高达几十万美元,不适合普遍使用。

另外,Quantech、TexasInstruments和EBI等公司也都研制出了自己的SPR仪器系统。




SPR传感器有四种主要的检测方法:角度调制,波长调制,相位调制,强度调制。其中,角度调制应用最普遍,如今市场上的商用仪器多数采用角度调制的方法。

将普通的SPR传感器与生物分子互作技术(biomolecular interactionanalysis,BIA)[8]相结合,就可以制作全新的SPR生物传感器件。因为SPR光谱随金属表面的折射率变化而变化,而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比,因而可通过对生物反应过程中SPR光谱的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。这样,它就能在不需使用荧光或同位素标记甚至无须纯化各种生物组分的天然条件下,通过传感器芯片实时监测各类生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂甚至全病毒、细胞之间相互作用的整个过程,并通过分析软件获取生物分子结合/解离、亲和性/特异性、协同/拮抗、反应速率/浓度变化等互作动力学参数。


当进行分子间相互作用分析时, 将其中一个反应物(称为配体) 偶联在传感片上, 含有另一个反应物(称作分析物)的样品通过蠕动泵以恒定的流速通过传感片表面, 分子间有结合反应而导致传感片表面分子浓度的变化将由SPR 信号的改变而得到测定,并以共振单位(RU) 作表达。以时间对共振单位(RU) 连续作图,得到的传感图记录了整个反应过程包括结合和解离过程(下图)。

表面等离子体共振 几何光学的基本定律
上图:典型的感应图。加入的分析物与结合在传感片上的配体反应导致信号上升,记录复合物的结合过程和平衡状态。当样品加完后分析物被缓冲液代替,此时信号的下降显示了解析过程。 从结合的量可反映出样品的浓度。

Au 膜和Ag 膜是SPR 中最常用的两种金属薄膜


测定结合反应的动态参数

  由于BIA是一项实时分析技术,得到的传感图不仅可以看出结合反应,同时也记录了整个反应的动态信息,反应的强弱和快慢通常可从传感图的曲线上看出。配以合理的实验设计和数据分析方法,结合BIA 技术,SPR生物传感器可测定反应的动态参数及亲和常数,并以此来论证提出的反应机理是否正确。生物分子相互作用实时分析仪配有一整套数据分析软件来分析得到的数据,从而提供反应的途径和机理。






不同液体的折射率也不同,对于同一种溶液,不同浓度也对应着不同的折射率,换句话说,液体成分的微小变化对应折射率的变化,这样,通过测量液体的折射率可以探测到液体成分的变化。这种探测过程在跟踪表面性质变化、化学反应进程及生物活性分子变化领域有着很实际的意义。基于这种原理,可以使用同一个金属薄膜,分别用不同的样品与之表面接触,测量共振角,可以测得不同液体间折射率的区别,进而了解所测液体的成分,这就是SPR传感器的传感原理。

通过调整光线在棱镜底面的入射角,使入射光(TM波)的波矢在界面方向的分量等于SPW的波矢,这样入射光的大部分的能量被耦合到表面,而棱镜底面全反射的光强明显下降。这种激励方式称为衰减全反射技术(ATR,AttenuatedTotal Reflection)。

采用Kreschman方法激发表面等离子波的传感器设计结构,其中三棱镜采用高折射率材料,金属层是在三棱镜底面利用真空蒸发镀膜工艺镀制厚度约为50nm的金层,样品盒利用聚四氟乙烯材料制作。

  

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