爱华网江西农业大学学报 ２０１６，３８（３）：５６５-５７２ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＪｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ
（３）：５６５-５７２．ＤＯＩ：１０．１３８３６／ｊ．ｊｊａｕ．２０１６０８１ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ｊｘａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ胡颂平，吴云花，邹国兴，等．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展［Ｊ］．江西农业大学学报，２０１６，３８
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导基因组编辑技术
在植物基因中的研究进展
胡颂平１，吴云花１，邹国兴２，聂元元２，杜 鹃１，
毛伟伟１，余 霞１，张 琳１∗
江西南昌３３０２００）（１．江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌３３００４５；２．江西省超级水稻研究发展中心／水稻国家工程实验室，
摘要：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导的基因组编辑技术是在ＤＮＡ双链的特定位置形成双链断裂，然后通过同源重组或非同源末端连接方式进行修复，造成基因组碱基局部缺失或插入而引起基因突变，它具有操作简单、突变效率高等优势。笔者归纳了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的基本结构、分类及其在植物基因中的研究进展和未来的发展方向。关键词：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；基因组；同源重组；基因突变
中图分类号：Ｑ７８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１０００-２２８６（２０１６）０３-０５６５-０８
ＴｈｅＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＧｅｎｏｍｉｃＥｄｉｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭｅｄｉａｔｅｄｂｙＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｉｎＰｌａｎｔｓ
ＨＵＳｏｎｇ-ｐｉｎｇ１，ＷＵＹｕｎ-ｈｕａ１，ＺＯＵＧｕｏ-ｘｉｎｇ２，ＮＩＥＹｕａｎ-ｙｕａｎ２，ＤＵＪｕａｎ１，ＭＡＯＷｅｉ-ｗｅｉ１，ＹＵＸｉａ１，ＺＨＡＮＧＬｉｎ１∗
３３０２００，Ｃｈｉｎａ）ＪｉａｎｇｘｉＳｕｐｅｒ-ｒｉｃｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒ／ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＲｉｃｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９-ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｏｍｉｃｅｄｉｔｉｎｇｃｏｕｌｄｇｅｎｅｒａｔｅｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｂｒｅａｋｓｉｎｓｐｅｃｉａｌ（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＪｉａｎｇｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３００４５，Ｃｈｉｎａ；２．ｓｉｔｅｓ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｒｅｐａｉｒｅｄｂｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｒｎｏｎ-ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇ，ａｎｄｉｔｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｂａｓｅｄｅｌｅｔｉｏｎｏｒｉｎｓｅｒｔｉｏｎｉｎｇｅｎｏｍｅ．ＴｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ａｒｅｓｉｍｐｌｅｏｐｅｒａｔｉｏｎａｎｄｈｉｇｈｅｆｆｉ-ｃｉｅｎｃｙｏｆｍｕｔａｔｉｏｎ．ＴｈｅａｒｔｉｃｌｅｄｅｓｃｒｉｂｅｓｔｈｅｂａｓｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ａｎｄｉｔｓｄｅ-ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｐｌａｎｔｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ｇｅｎｏｍｅ；ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ
近年来，基因组编辑技术为生物学研究开辟了新的研究领域，它是研究基因功能和基因治疗的重要方法。早期，研究人员利用同源重组（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＨＲ）的方法对基因进行改造修饰， 收稿日期：２０１５-１２-２４ 修回日期：２０１６-０１-１４
（２０１０ＧＺＮ００３８、Ｓ２０１６ＺＲＺＤＢ００４３）基金项目：国家自然科学基金项目（３１２６０３１４）、国家留学基金项目（２０１４０８３６００３４）和江西省自然科学基金项目
ＰｒｏｊｅｃｔｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（３１２６０３１４），ＣｈｉｎａＳｃｈｏｌａｒｓｈｉｐＣｏｕｎｃｉｌ
作者简介：胡颂平（１９６９—），男，教授，主要从事植物分子育种与植物细胞工程研究，ｓｐ６９７４＠１６３．ｃｏｍ；∗通信作者：
张琳，ｚｈａｎｇｌｉｎ０６＠１６３．ｃｏｍ。（２０１４０８３６００３４）ａｎｄＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＪｉａｎｇｘｉ（２０１０ＧＺＮ００３８，Ｓ２０１６ＺＲＺＤＢ００４３）
·５６６· 江西农业大学学报第３８卷发现这种方法的精确度很高，但其打靶效率极低（１０-６～１０-９）［１］。随着锌指核酸酶（ｚｉｎｃ-ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａ-ｓｅｓ，ＺＦＮｓ）［２-３］、类转录因子效应物核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ-ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＴＡＬＥＮｓ）［４-７］和巨核酶技术（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）［８］等ＤＮＡ核酸酶的发现和合成改变了这一现状，这些ＤＮＡ核酸酶能够在基因组特定的位置形成双链断裂（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｏｋｅｎ，ＤＳＢ），然后通过非同源末端连接（ｎｏｎ-ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）和同源重组进行修复，造成基因组局部碱基的缺失或者插入而起到基因编辑的作用［９］。其中巨核酶是由核酸酶和ＤＮＡ的结合位点组成，ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ是由ＤＮＡ结合位点与ＦｏｋＩ酶相互结合组成。虽然ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ和巨核酶技术能够使基因在特定的位点产生突变，但是具有打靶位点少、周期长、载体结构复杂、所需时间长等缺点［１０］。２０１３年，另一种新的具有代表意义的基因编辑技术ＣＰＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术诞生，它的工作机理与ＤＮＡ核酸酶类似，在ＤＮＡ的特异位点形成双键断裂，再由同源重组或非同源末端连接对ＤＮＡ进行修复，它具有载体结构简单、效率高、打靶位点多、花费低等特点［１０-１１］。这种技术已广泛用于人类、小鼠、细菌、酵母菌、斑马鱼、拟南芥、水稻、小麦、果蝇、玉米、烟草等基因组编辑［１２-２１］。１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的基本结构和类型
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统主要由成簇规律的短回文序列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅ-ｐｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ）和编码核酸酶的Ｃａｓ基因组成，成簇规律的短回文序列主要由短小的正向重复序列和完全不同的间隔序列交替组成。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统主要存在于细菌和古生菌中，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统中的重７２ｂｐ［２２-２４］。科学家研究发现，在已研究调查的细菌基因组中有４０％的基因组中存在ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ位点［２５］。不同物种ＣＲＩＳＰＲ位点的数量不同，在已检测到ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的细菌中，有１／２的细菌含有多个ＣＲＩＳＰＲ位点，并且平均每个位点有２７个重复序列，重复序列的平均长度为３２ｂｐ［２６］。在正向重复序列的上游存在长度约为２００ｂｐ的前导序列，它主要用于启动ＣＲＩＳＰＲ序列的转录［２７］。在ＣＲＩＳＰＲ或者病毒进行降解。附近存在多种类型的Ｃａｓ基因。多种Ｃａｓ基因编码的Ｃａｓ蛋白能够形成复合体，对外源入侵的噬菌体１９８７年，研究人员在大肠杆菌中发现长度为２９ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）的重复序列被３２ｎｔ的非重复序列分复序列是一段长为２１～４７ｂｐ的回文重复序列，间隔序列的长度与重复序列的长度相似为２１～隔开的ＣＲＩＳＰＲ序列［２８］。２００２年，科学家对ＣＲＩＳＰＲ序列正式进行命名，同时在ＣＲＩＳＰＲ的附近发现一些与重复序列有关能够编码Ｃａｓ蛋白的编码基因［２７］。随后，研究人员发现ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统有３种类型，分别为ＴｙｐｅＩ、ＴｙｐｅＩＩ、ＴｙｐｅＩＩＩ。而且３种类型的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统主要由Ｃａｓ基因家族和ＣＲＩＳＰＲ序列元件组成［２９］。ＴｙｐｅＩ系统在细菌和古生菌中都有发现，它包含６个亚型，所有的亚型中都有Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ３蛋白［３０］。Ｃａｓ３蛋白是ＴｙｐｅＩ系统中的标志性蛋白，它有一个磷酸水解酶结合位点和一个解旋酶结合位点，并且它能够和不同Ｃａｓ蛋白形成复合体与ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ-ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡ）进行结合形成ＣＡＳＣＡＤＥ（ＣＲＩＳＰＲａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒａｎｔｉｖｉｒｕｓｄｅｆｅｎｓｅ）复合体，然后，通过原间隔序列（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）下游保守序列（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆｓ，ＰＡＭ）来识别ＤＮＡ靶序列，使ＤＮＡ的结构发生变化［３１-３４］。ＴｙｐｅＩ系统中ＰＡＭ位点一般为２～３个碱基，并且在不同的亚型中序列的长度不同。ＴｙｐｅＩＩ系统只在细菌中有发现，这个系统有一个多功能的Ｃａｓ９蛋白。Ｃａｓ９蛋白有２个特征性的核酸酶结构域分别是ＲｕｖＣ和ＨＮＨ，其中ＨＮＨ是一个单一的核酸酶结构域，ＲｕｖＣ包括３个子结构域ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ。ＲｕｖＣＩｔｒａｃｒＲＮＡ-Ｐｒｅ-ｃｒＲＮＡ在ＲＮａｓｅＩＩＩ的作用下完成ｐｒｅ-ＲＮＡ的成熟形成ｃｒＲＮＡ［３５-３６］。ＴｙｐｅＩＩ系统中ｐｒｏｔｏ-在Ｃａｓ９蛋白的Ｎ端，而ＲｕｖＣＩＩＩ和ＲｕｖＣＩＩ与ＨＮＨ侧面相接在蛋白的中央。Ｃａｓ９蛋白能够促进ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ-ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ）与ＣＲＩＳＰＲ重复序列前导区转录形成的ｐｒｅ-ｃｒＲＮＡ进行配对，使ｓｐａｃｅｒ序列下游的ＰＡＭ是一个为５个碱基的保守序列（ＮＧＧＮＧ），ｔｒａｃＲＮＡ与ｃｒＲＮＡ配对形成的二聚体通过对ＰＡＭ保守序列的识别，引导Ｃａｓ９蛋白在距离ＰＡＭ位点３～８个碱基的位置对目标序列进行剪切。ＴｙｐｅＩＩＩ系统主要存在于古生菌中，它包括ＴｙｐｅＩＩＩＡ、ＴｙｐｅＩＩＩＢ２个亚型［３１-３２］。Ｃａｓ６蛋白和Ｃａｓ１０蛋白是ＴｙｐｅＩＩＩ系统的特征性蛋白。ＴｙｐｅＩＩＩＡ系统包括５种Ｃａｓ蛋白，在此系统中不需要特异性的ＰＡＭ保守序列，并且与ｃｒＲＮＡ序列５′端８个核苷酸互补的序列不能作为靶序列［３７-３８］。在ＴｙｐｅＩＩＩＢ中Ｃａｓ６蛋
第３期胡颂平等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展·５６７·白是对抵抗外源ＤＮＡ必不可少的一部分。并且ｃｒＲＮＡ序列５′端的８个核苷酸是６种Ｃａｓ蛋白形成复合体的嵌合点。ＴｙｐｅＩＩＩ系统同样是通过ｃｒＲＮＡ与多种Ｃａｓ蛋白形成复合体对外源ＤＮＡ进行剪切。切酶主要来自酿脓链球菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统［３９］。２０１２年，研究人员发现，ｃｒＲＮＡ在试管中也能引导Ｃａｓ９蛋白对目标序列进行剪切，并且在同一年，一条由ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ嵌合而成的单链引导ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）诞生［３６，３９］。ｓｇＲＮＡ合成使ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统不需要ＲａｓｅＩＩＩ的作用，直接就能引导Ｃａｓ９对目标序列的剪切使ＤＮＡ双键断裂，并以同源重组或非同源末端连接等方式对ＤＮＡ进行修复。异源体ｓｇＲＮＡ引导Ｃａｓ９对目标序列的剪切比ｃｒＲＮＡ更加高效。２０１３年，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统成功地用于哺乳动物基因编辑［４０］。目前这项基因编辑技术已广泛地运用于多种动植物基因中。现在广泛用于基因编辑技术的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统是根据ＴｙｐｅＩＩ系统进行改造而来的，Ｃａｓ９核酸内２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的免疫机制
细菌和古生菌中ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统主要是为了抵御外界噬菌体或病毒的侵入而形成的自身免疫系统。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的免疫机制主要为以下几个方面。首先，当病毒或噬菌体侵入细菌时，细菌中ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系统中的外源ＤＮＡ特定的原间隔序列（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）和ＰＡＭ序列对外源ＤＮＡ进行识别，并毒再一次侵染宿主菌时，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的前导区会转录形成ｐｒｅ-ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ-ｃｒＲＮＡ）。此转录必须同时存在启动子元件和Ｃａｓ蛋白结合位点的情况下才能发生［４３-４４］。Ｐｒｅ-ｃｒＲＮＡ在核酸内切酶和ｔｒａｃｒＲＮＡ的加工下形成成熟的ｃｒＲＮＡ，成熟的ｃｒＲＮＡ包括间隔序列、５′端羟基的重复序列和２～３个磷酸化循环末端［４５-４６］。ｃｒＲＮＡ与Ｃａｓ蛋白结合形成复合体对外源入侵的噬菌体或者病毒进行攻击而致使核酸降解［４７］，而达到对自身免疫的作用。且宿主菌将外源ＤＮＡ重新整合进入ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统中的间隔序列［４１-４２］，形成“记忆”。当噬菌体或病３ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９在植物中的研究进展
２０１３年，Ｆｅｎｇ等［１３］在ｓｇＲＮＡ载体上分别连接ＡｔＵ６-２６启动和ＯｓＵ６-２启动子来调控ｓｇＲＮＡ在不同植物中的瞬时表达。发现带有ＡｔＵ６-２６启动子的ｓｇＲＮＡ适合用于拟南芥等双子叶植物基因编辑，带有ＯｓＵ６-２启动子的ｓｇＲＮＡ适合用于水稻等单子叶植物基因编辑。目前，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术已经３．１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在单子叶植物中的研究进展广泛用于各种植物的基因编辑。
２０１３年，Ｘｉｅ等［４８］构建带有ＣａＭＶ３５Ｓ启动子ＣＡＳ９载体和带有Ｕ３或Ｕ６启动子的ｓｇＲＮＡ表达载体，并利用这套ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统靶向水稻的ＯｓＭＰＫ５基因。研究发现，利用原生质体瞬时表达转化载体，在转化后１８ｈ，其转化率达到了６０％，在３６～７２ｈ其转化达到９０％。进行非同源末端连接修复发生缺失突变和插入突变的比例为１∶１，其中缺失突变的片段大小为３～１４ｂｐ，插入突变的片段大小为４２～１９５ｂｐ。对转基因植株进行检测发现基因突变的效率为３％～８％。２０１４年，Ｚｈａｎｇ等［４９］利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９编辑技术对水稻的１１个不同基因进行基因编辑，发现在Ｔ０代植株中突变植株的平均概率为４４％，这些突变植株中有４％的植株是双等位突变，并且这些突变植株都能稳定遗传给下一代。对突变植株的ＤＮＡ序列进行测序发现这些植株中极少数存在脱靶的现象。２０１３年，研究人员［５０］设计了ｓｇＲＮＡ和双链ｃｒＲＮＡ-ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｄｕａｌ-ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡｓ）对水稻内源基因进行研究，探索这２种ＲＮＡ对２个外显子和控制分蘖夹角的ＬＡＺＹ１基因的第３个外显子设计目标序列，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术分别对这２个外显子进行编辑，利用农杆菌转化水稻的愈伤组织。ＣＡＯ１基因在苗期开始表现功能缺失，叶片呈现淡绿色。在水稻的分蘖时期，ＬＡＺＹ１基因表现功能缺失，分蘖性状为散射状。对ｓｇＲＮＡ引导的Ｔ０代突变植株进行统计发现２个基因的突变率分别达到了１３．３％和５０％，其中Ｔ１代植株中为突变植株的概率分别是８３．３％和９１．６％，而ｄｕａｌ-ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡｓ引导的２个基因突变率只有４．４４％，由此说明，在产生内源基因的定点突变基因方面ｓｇＲＮＡ引导的系统比ｄｕａｌ-ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡｓ引导的系统效率更高。２０１５年，Ｍｉｋａｍｉ等［５１］将Ｃａｓ９和ｓｇＲＮＡ两个表达组件转入一个双运表达载体中，对控制水稻叶色的ＰＤＳ（ｐｈｙｔｏｅｎｅｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）基因和控制叶片垂直度的ＤＬ（ｄｒｏｐｐｉｎｇｌｅａｆ）基因进行编辑，检测在一水稻的内源基因编辑效率的高低。在控制水稻叶绿素含量的ＣＡＯ１（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌＡｏｘｙｇｅｎａｓｅ１）基因的第
·５６８· 江西农业大学学报第３８卷个表达载体中ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的打靶效率。研究发现，ＰＤＳ基因转化愈伤组织的转化率为９０．４％。愈伤组织再生成为突变植株的概率为４２．１％，其中发生等位双突变的植株叶片呈现白化的现象。ＤＬ基因中的４个靶点发生突变的最高频率为９３％，愈伤组织的转化率为１００％，发生等位双突变的植株出现叶片严重下垂的现象。由此说明Ｃａｓ９与ｓｇＲＮＡ在同一个表达载体中的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统能够高效地对基因进行编辑。２０１４年，Ｘｕ等［５２］利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９编辑技术针对水稻抗除草剂ＢＥＬ（ｂｅｎｔａｚｏｎｓｅｎ-ｓｉｔｉｖｅｌｅｔｈａｌ）基因的第２个外显子设计靶序列，并且利用农杆菌介导转化植物愈伤组织。对转基因植株进行测序分析发现，在９０株转基因植株中有１５株发生碱基的缺失或碱基替代，并且筛选出一株双等位（在第１７个碱基和第１４个碱基处都发生碱基缺失）突变株系。对与双突变型植株处于同样生长期野生型植株同时喷射等量的除草剂，发现野生型植株的叶子没有变化，而双突变植株的叶子为黄色并且有严重褶皱。Ｍａｘ等［５３］利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对水稻基因设计４６个靶位点，检测到这些靶点的平均突变频率为８５．４％，主要的突变类型是双等位突变和同源突变。Ｘｉｎｇ等［５４］以玉米ＺｍＨＫＴ１基因作为靶基因，在靶基因上设置２个不同的靶点，检测ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在单子叶植物中的突变效率。研究结果发现，每个靶点平均发生突变的转基因植株占所得转基因植株的６０％。Ｕｐａｄｈｙａｙ等［１８］针对小麦ｉｎｏｘ（ｉｎｏｓｉｔｏｌｏｘｙｇｅｎａｓｅ）基因和ＰＤＳ（ｐｈｙｔｏｅｎｅｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）基因设２２％，其中ｉｎｏｘ基因发生缺失突变最大的片段是２４ｂｐ，插入突变最大的片段是２２ｂｐ，并且在距离研究人员用一个原间隔序列的ＰＡＭ同时对ｉｎｏｘ基因和ＰＤＳ基因进行打靶，研究结果发现，ＰＤＳ基因发３．２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９在双子叶植物中的研究进展生突变的效率为１０％，ｉｎｏｘ基因发生突变的效率为８％［１８］。计靶序列，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术对基因进行编辑，在原生质体中检测到两个基因突变效率为１８％～ＰＡＭ２～３个碱基处发生插入或缺失突变。为了检测ＣＲＩＳＰＥ／Ｃａｓ９系统同时打靶两个不同基因的效率，
２０１３年，Ｆｅｎｇ等［１３］利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对拟南芥耐油菜素类固醇ＢＲＩＬ基因和赤霉素ＧＡＩ基因进行基因编辑，共获得５０株Ｔ１代转基因植株和２０株Ｔ０代转基因植株，其中，Ｔ１代转基因植株在拟南芥早期生长阶段就表现出多种生长表型，以ＢＲＩＬ基因为靶序列的转基因植株在Ｔ１代有５０％表现出生长阻滞、叶片卷曲，ＧＡＩ转基因植株在Ｔ１代中有四分之一的植株外形矮小。第２年，Ｆｅｎｇ等［５５］又对拟南芥的７个基因共１２个靶点进行编辑，在Ｔ１代、Ｔ２代、Ｔ３代转基因植株中检测的突变效率分别为传到Ｔ３代植株中。Ｘｉｎｇ等［５４］对ｐ２ｇＲ-ＴＲＩ-Ａ和ｐ２ｇＲ-ＴＲＩ-Ｂ２个载体构建不同的ｓｇＲＮＡ（Ｔ１Ａ-ＴＣ和Ｔ１Ｂ-ＴＣ），这２个载体同时打靶控制拟南芥表面毛状物的两个基因（ＴＲＹ和ＣＰＣ），研究发现，以Ｔ１Ａ-ＴＣＴ１代植株中只有少于１０％的植株是所需要的转基因植株。Ｊｉａｎｇ等［５６］构建含有Ｕ６启动子ＣＲＩＳＰＲ／ＴＲＩ-Ａ载体的Ｔ１代转基因植株有７０％的株系的叶片表面都是高密度的毛状物，而ｐ２ｇＲ-ＴＲＩ-Ｂ载体的Ｃａｓ９的双运载体对无功能的ＧＦＰ基因进行打靶使无功能ＧＦＰ基因突变为有功能的ＧＦＰ，对Ｔ０代转基因植株进行潮霉素筛选和ＰＣＲ检测，从稳定遗传到Ｔ１代的拟南芥突变植株叶片中可以观察到绿色荧光信号，而且其突变性状能够稳定的遗传到Ｔ２代和Ｔ３代植株中。Ｈｙｕｍ等［５７］针对拟南芥的ＦＴ（Ｆｌｏｗ-ｅｒｉｎｇｌｏｃｕｓＴ）基因和ＳＰＬ-４（Ｓｑｕａｍｏｓａｐｒｏｍｏｔｅｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ-ｌｉｋｅ４）基因进行靶点设计，在Ｔ１代转基因植株中均检测到突变位点。ＦＴ突变植株在Ｔ１代表现出开花延迟，这些突变植株中９０％的植株表现单碱基插入或小片段缺失的突变类型。Ｗａｎｇ等［５８］从８个卵细胞特有的启动子与２个不同的终止子（ｐｉ-ｓｕｍｓａｔｉｖｕｍｒｂｃＳＥ９、ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｏｓ）形成１２个组合中筛选最适合用于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统编辑的终止子和启动子。利用农杆菌转化拟南芥胚胎形成的愈伤组织。研究发现，采用２个启动子融合的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的打靶效率高于单个启动子的效率，其纯合突变或双等位突变效率达到３８．８％。Ｙｉｎ等［５９］构建以烟草ＰＤＳ为靶基因、卷叶虫病毒和ＴＤＮＡ载体为基础含有Ｕ６启动子和ｇＲＮＡ的７１．２％、５８．３％、７９．４％。其中Ｔ２代突变植株中有２２％的纯合突变植株，并且这些纯合突变都能稳定的遗为ｓｇＲＮＡ的载体与目标基因之间发生１个错配，Ｔ１Ｂ-ＴＣ与目标基因之间发生２个错配。靶向ｐ２ｇＲ-病毒载体（ｐＣＶＡ-ｇＲＮＡ：：ＮｂＰＤＳ／ｐＣＶＢ），通过对Ｃａｓ９表达载体能够高效表达的转基因烟草（ＫＱ３３４）叶片注射病毒载体使病毒侵染到植物细胞，并且通过自身的复制使ｇＲＮＡ表达。最后Ｃａｓ９蛋白在ｇＲＮＡ的引导下对靶基因进行剪切而达到基因编辑的目的（ＶＩＧＥ）。研究发现，有３０％ＫＱ３３４植株叶片在连续注射ｐＣＶＡ-ｇＲＮＡ：：ＮｂＰＤＳ／ｐＣＶＢ的第３个星期出现了光学漂白的现象，在１２个星期时可以观察到
第３期胡颂平等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展·５６９·明显的现象，而只注射了ｐＣＶＡ-ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｐＣＶＢ载体的叶片并没有出现该现象。对具有明显光学漂白的叶片进行ＰＣＲ和测序检测发现ＰＤＳ基因已经发生突变，有１～８ｂｐ的碱基发生缺失，１ｂｐ的碱基发生插入。研究人员以控制烟草叶色的ＮｂＩｓｐＨ基因为靶序列设计ｐＣＶＡ-ｇＲＮＡ：：ＮｂＩｓｐＨ／ｐＣＶＢ载体进一步验证ＶＩＧＥ编辑技术，有５０％ＫＱ３３４的植株叶片在连续注射ｐＣＶＡ-ｇＲＮＡ：：ＮｂＩｓｐＨ／ｐＣＶＢ载体后出现光学漂白现象。运用ＰＣＲ检测光学漂白现象明显的植株，发现基因突变效率为７５％。Ｇａｏ等［６０］构建其突变植株的叶片呈现黄色，ＮｔＰＤＲ６基因的突变频率８７．５％，其突变植株的枝条比野生型多。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统诱导烟草ＮｔＰＤＳ基因和ＮｔＰＤＲ６基因突变。其中，ＮｔＰＤＳ基因的突变频率为８１．８％，４ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统面临的挑战和未来的发展
尽管ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９已经广泛地运用于各种生物的基因编辑，但是，系统中某些结构的作用机制还４．１ 提高ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的特异结合能力和效率不明确，而且某些应用还需要进一步的提高。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的一个关键需要是最大限度地减小脱靶的影响。目前，也有几种方法用于减少脱靶的影响，如：缩短ｇＲＮＡ的长度，使用双切口酶，运用ｄｃａｓ９-ＦｏｋＩ复合体等，然而一个ｇＲＮＡ序列可能有很多的脱靶位点，每个位点都需要实验数据分析其脱靶的影响。近年来也有许多检测脱靶方法生成。如Ｋｉｍ等［６１］运用Ｄｉｇｅｎｏｍｅ-ｓｅｑ方法分析基因脱靶的影响，Ｆｒｏｃｋ等［６２］运用ＨＴＧＴＳ（Ｇｅｎｏｍｅ-ｗｉｄｅ的基因编辑，研究者也希望有更多的方法能够用于检测基因脱靶和减少脱靶效率。ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法对ＤＮＡ双链的断裂进行检测。随着ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统用于越来越多生物
众所周知，高效的基因编辑的特异性位点核酸酶的选用是依据基因组不同遗传组合和不同特异性位点的表观遗传状态来选择的。例如，每条ＤＮＡ的可编辑性都有一一对应的转录因子结合和最新的Ｃａｓ９蛋白结合［６３-６４］，各种各样的组蛋白修饰也都有一一对应的转录因子和染色体结构［６５-６７］。由于复杂催化活性和高效的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的影响都没有深入的理解。而对ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统机制深入了４．２ 扩大ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的适用范围。
目前，基因编辑技术主要用于内源基因的功能性缺失突变和修饰，而以ＣＲＩＳＰＲ为基础的基因编辑技术主要是专注于Ｃａｓ９核酸酶的发展。在ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统类型和功能的多样性等方面的研究还是比较欠缺，只有少量的研究报道过这方面相关的某些研究。２０１２年，Ｈａｌｅ等［４３］从强烈火球菌和硫磺矿硫化叶菌中鉴定出的ＣａｓＲＡＭＰ蛋白能够与ｓｇＲＮＡ形成复合物对目标ＲＮＡ进行剪切。ＣａｓＲＡＭＰ蛋白的剪切位点在目标序列的５′端，目标序列主要由６个碱基的中心区域和另外１３个碱基组成。２０１３年，Ｃｈｅｎ等［６８］通过对ｔｒａｓｃｒＲＮＡ的茎环结构增加一个Ａ-Ｕ环，成功地将ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统高效地运用于基因抑制和对基因位点的分类。此外，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ等［６９］和Ｚａｌａｔａｎ等［７０］发现ｓｇＲＮＡ中不同的茎环结构通过结合不同的转录因子来起到激活基因和抑制基因的作用。并且，Ｚａｌａｔａｎ等［７０］发现带有不同茎环的ｓｇＲＮＡ靶向不同的基因位点，同一个ｄＣａｓ蛋白在不同的位点执行的功能不同。随着科学技术的不断发展基因编辑技术的应用越来越广泛，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导的基因编辑的适用范围也需要不断的拓展。解能够提高基因编辑方面的准确性和效率。的遗传序列、表观遗传修饰和不同的遗传位点交叉在不同的细胞中，至今研究人员对位点的结合机制，５ 展望
传统的基因编辑技术如基因枪法、花粉管道法和农杆菌介导Ｔ-ＤＮＡ插入法，将外源基因随机地插入到植物基因组中，进而获得相应性状的植株。由于随机向基因组插入目标基因，对宿主基因造成的伤害不能够预计，它可能导致内源基因受损或外源基因沉默。由于植株基因组中自发地发生同源重组的概率很低，想要获得特定位点发生基因突变的目标性状概率更低。但是，当植物基因组中的双链发生断裂时，基因发生同源重组和非末端同源重组的概率大大地提高。而现在广泛用于基因编辑的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统就是利用ＤＮＡ在特定位点形成双链的断裂，再在同源重组或非末端同源重组的作用下，造成碱基的插入或者缺失使基因组发生突变。相较于传统的基因编辑技术，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导的基因组编辑技术具有操作简单，效率高，适用范围广、花费低等优点，它是基因工程研究方面的一个新思路和新方
·５７０· 江西农业大学学报第３８卷法，它将有可能在生物技术领域上产生积极的作用。
断改进和提高，例如，如何解除ＰＡＭ序列的限制、如何最大范围地减少脱靶突变、如何构建在不同物种中通用的Ｃａｓ９与ｓｇＲＮＡ体系，怎样提高同源重组修复效率等。随着基因工程不断深入地研究，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在动植物基因改造、作物遗传育种、基因转录调控、表观遗传调控、动植物品种改良等方面将有更广阔的发展前景。
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第３期胡颂平等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展·５７１·［２３］ＭｏｊｉｃａＦＪ，ＦｅｒｒｅｒＣ，ＪｕｅｚＧ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇｓｔｒｅｔｃｈｅｓｏｆｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｌａｒｇｅｓｔｒｅｐｌｉｃｏｎｓｏｆｔｈｅａｒｃｈａｅａ
（１）：８５-９３．ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８９，１７１（６）：３５５３-３５５６．ＨａｌｏｆｅｒａｘｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉａｎｄＨａｌｏｆｅｒａｘｖｏｌｃａｎｉｉａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｐｌｉｃｏｎｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５，１７［２４］ＭｏｊｉｃａＦＪ，Ｄｉｅｚ-ＶｉｌｌａｓｅｎｏｒＣ，ＳｏｒｉａＥ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆａｆａｍｉｌｙｏｆｒｅｇｕｌａｒｌｙｓｐａｃｅｄｒｅｐｅａｔｓｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｏｆ［２５］ＧｏｄｄｅＪＳ，ＢｉｃｋｅｒｔｏｎＡ．ＴｈｅｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅＤＮＡｅｌｅｍｅｎｔｓｃａｌｌｅｄＣＲＩＳＰＲｓａｎｄｔｈｅｉｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ［２６］ＢｌａｎｄＣ，ＲａｍｓｅｙＴＬ，ＳａｂｒｅｅＦ，ｅｔａｌ．ＣＲＩＳＰＲｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔｏｏｌ（ＣＲＴ）：ａｔｏｏｌｆｏｒａｕｔｏｍａｔｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙ［２７］ＪａｎｓｅｎＲ，ＥｍｂｄｅｎＪＤ，ＧａａｓｔｒａＷ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｔｈａｔａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＤＮＡｒｅｐｅａｔｓｉｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ［Ｊ］．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００７，８：２０９．ｔｒａｎｓｆｅｒａｍｏｎｇｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ［Ｊ］．ＪＭｏｌＥｖｏｌ，２００６，６２（６）：７１８-７２９．ａｒｃｈａｅａ，ｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３６（１）：２４４-２４６．
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·５７２·
江西农业大学学报第３８卷
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