爱华网[关键词] 高分辨率熔解曲线；金银花；种质鉴定
[Abstract] To establish a new high resolution melting analytical method for identification of Lonicera japonica germplasm，the screening of 7 pairs of SSR （simple sequence repeats） primers，determining the suitable diagnostic primers by the differences of peak pattern and Tm was conducted. Then into the DNA template concentration，annealing temperature and the suitable range of cycle number were investigated. Combined with SIMCA-P software for data processing analysis，the results show that three main germplasm honeysuckle could be divided by four sets of primers. It provides methodology for improving L. japonica germplasm identification.
[Key words] high resolution melting；Lonicerae Japonicae Flos；germplasm identification
doi：10.4268/cjcmm20162415
药材金银花的基原植物为忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.，在长期的栽培过程中其形态发生了明显的变异和分化，形成了很多农家栽培品种或品系[1-2]。近年来，随着金银花价格走高，栽培面积扩大，新兴产区与传统产区间交互引种，致使出现同质异名或异质同名情况，限制了生产发展和种植效益的提高。由于不同种质金银花在植株形态、药材产量与质量等方面均表现出明显差异，因此建立合适的种质资源鉴定方法，对于金银花的种质资源评价、良种选育、规范种子种苗市场以及保障药材品质均有重大意义。利用分子生物学技术进行种质资源分类与鉴定已取得重要进展，本课题组前期通过对金银花栽培种质进行调查与分类，表明7对SSR（简单重复序列，simple sequence repeats）引物的指纹图谱可作为“分子身份证”区分全国58个金银花种质[3-4]，但该方法需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱进行检测，操作复杂、耗时长。
为了建立准确、快速、可视化的主栽种质鉴定方法，本研究将高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve analysis，HRM）技术应用于金银花种质SSR鉴定中。高分辨率熔解曲�分析是在实时荧光定量PCR基础上发展起来的一项新技术，其通过监测DNA双螺旋随温度升高时解链情况变化，具有简便、快速、高通量、对样本无污染等优点，在中药鉴定中显示出良好的应用前景 [5]。使用HRM技术检测SSR标记，与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分型相比，不需要PCR后续处等步骤，大大降低了检测时间并提高了灵敏度和特异性[6-7]。本研究使用HRM技术检测金银花种质的7对SSR鉴定标记，通过熔解曲线峰型及Tm差异，实现了金银花3个主栽种质的可视化鉴定，为金银花种质的栽培、流通、追溯监管及仲裁提供依据。
1 材料
1.1 仪器
Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（Roche公司），DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂），5810R型低温冷冻离心（Eppendorf公司） ，MM 400型混合型球磨仪（Retsch公司），数显恒温水浴锅（HH-2型，国华电器有限公司），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene公司，型号GBOXHR）。
1.2 试剂
改良 2×CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液，含有2%CTAB，100 mmol・L-1Tris-HCl （三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0）、20 mmol・L-1乙二胺四乙酸二钠（pH8.0）、2.5 mol・L-1氯化钠；无水乙醇、异戊醇、巯基乙醇购自天津市永大化学试剂有限公司，均为国产分析纯；LC Green Plus（Idaho公司）。
1.3 样品
收集了来自河北、河南、山东等地的8个金银花种质，分别为：一线红、巨花一号、线花一号、四季花、鸡爪花、亚特红蕾、亚特良种、九丰一号，采样量为10～30株。采集样品为忍冬头茬花，包括二白期花蕾、带叶新枝、带花新枝等，单株取样，样品用硅胶干燥后保存于中国中医科学院中药资源中心。
2 方法
2.1 模板DNA提取 取100 mg实验材料，液氮环境下研磨，采用改良CTAB法提取样品总DNA[9]。经琼脂糖凝胶电泳检测后用核酸定量仪检测定DNA浓度，调整DNA终浓度约50 mg・L-1，作为模板用于PCR扩增。
2.2 PCR扩增与熔解曲线分析
以不同种质的金银花DNA为模板，在Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增及熔解曲线分析。25 μL PCR反应体系，包括10×buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，正反向引物各0.25 μL，LC Green Plus 2 μL，rTaq酶1 μL，DNA模板1 μL及dd H2O 17.8 μL。PCR反应及熔解曲线程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，X ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35个循环；再延伸72 ℃ 7 min；PCR结束后进行熔解曲线分析：95 ℃ 变性1 min，40 ℃ 1 min形成异源双链DNA，而后升温至70 ℃，最后从70 ℃至97 ℃，期间每个温度点采集15个荧光值。 X ℃表示退火温度依据引物不同而不同，见表1。
2.3 引物筛选
以8个不同种质的金银花DNA为模板，考察SSSR9008219等7对金银花种质鉴定引物HRM分析熔解曲线峰形和Tm差异的影响，筛选出合适的鉴别引物。SSR信息、扩增片段长度，引物序列及PCR反应条件见表1。
2.4 条件优化
分别考察了DNA模板浓度，退火温度以及循环次数对于熔解曲线峰形和Tm的影响，确定可依据峰形和Tm鉴别不同种质金银花的条件并考察重复性。
2.5 数据分析
采用SIMCA-P11.5对熔解曲线荧光信号进行主成分分析，根据分离度筛选引物。
3 结果与分析
3.1 金银花种质HRM鉴定引物的筛选
为获得适用于金银花种质HRM鉴定引物，以8个金银花常见种质的DNA作为模板，利用SSSR9008219等7对金银花种质SSR鉴定引物进行HRM检测，依据其熔解曲线荧光信号进行主成分分析，筛选出分离度好的引物进行进一步研究。
结果表明引物SSSR9008219，SSR9118060，SSR9122370，SSR9553121的熔解曲线，可以区分种质一线红、亚特红蕾、九丰一号和其他金银花种质。
引物SSSR9008219以亚特良种为基线作差异曲线，亚特红蕾82.9 ℃具有单一拐点，九丰一号83.4 ℃具有单一拐点，与其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，亚特红蕾与九丰一号均为双峰，Tm分别为（77.71±0.06），（83.52±0.03）℃ 以及（76.78±0.06），（83.51±0.11）℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，九丰一号、亚特红蕾、一线红均表现出较大的分离度，优于HRM差异曲线结果，可专属性鉴定这3个种质，见图1。
引物SSR9118060归一化曲线中，一线红具有74.4，75.7，77.6 ℃ 3个拐点，与其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，一线红为双峰，Tm分别为（75.17±0.13），（78.64±0.05） ℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，一线红、亚特红蕾、九丰一号均表现出较大的分离度，优于归一化曲线结果，可专属性鉴定这3个种质，见图2。
引物SSR9122370归一化曲线中，九丰一号具有78.5，82，83.9 ℃ 3个拐点，�c其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，九丰一号为双峰，Tm分别为（79.26±0.08），（84.86±0.04） ℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，亚特红蕾、九丰一号均表现出较大的分离度，优于归一化曲线结果，可专属性鉴定这2个种质，见图3。
引物SSR9553121归一化曲线中，亚特红蕾78.6 ℃具有单一拐点，以亚特红蕾为基线作差异曲线，也可见与其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，亚特红蕾为单峰，Tm为（79.43±0.03）℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，线花一号、亚特红蕾、九丰一号均表现出较大的分离度，优于归一化熔解曲线结果，可专属性鉴定这3个种质，见图4。
通过归一化曲线和主成分分析2个方法进行分析和对比，可以看出，同种引物相同条件下，金银花不同种质在种质间表现出较大差异，可专属鉴别相应种质，结合筛选所得4个引物，利用种质间差异可以分别鉴别一线红、亚特红蕾、九丰一号3个种质。通过熔解曲线峰形Tm并计算其RSD，考察不同种质种质内差异性，结果表明金银花不同种质内差异较小，高分辨率熔解曲线法可鉴定相应种质，见表2。
3.2 HRM鉴别条件优化结果
3.2.1 DNA模板浓度 随机选取金银花DNA为模板，逐级调整其质量浓度为30，40，50，60 mg・L-1以SSR9118060为引物，退火温度为52 ℃，在35个循环的条件下进行HRM分析，结果表明其峰形和Tm在30～60 mg・L-1无明显差异。
3.2.2 循环数筛选 以SSR9118060为引物，退火温度为52 ℃，分别选择30，35，40为循环数，进行HRM分析并对其峰形及Tm进行比较。结果表明，在30个循环条件下，扩增出的曲线难以成形，可能与扩增效率低有关，在35，40个循环下，DNA熔解曲线峰型一致，Tm无明显差异。 3.2.3 退火温度筛选 以SSR9118060为引物，依次调整退火为48，50，52，54 ℃，在35循环下进行扩增，HRM分析并对其峰形及Tm进行比较。结果表明不同的温度下Tm差异介于0～1.43，无明显差异，峰形结果显示，温度在50～54 ℃有较为稳定的区分度。
3.2.4 重复性 为测试操作重复性，取1个金银花DNA样品，分成9份，使用SSR9118060为引物同时进行扩增，分析高分辨率熔解曲线分型结果，峰形一致，计算其峰Tm为（79.26±0.07），（84.86±0.04） ℃；RSD为0.080%，0.050%。将同一个金银花样品分成4份，使用SSR9118060为引物进行扩增，分4次连续进样，分析高分辨率熔解曲线结果，计算其峰Tm为（79.30±0.13），（85.05±0.24） ℃；RSD为0.18%，0.33%。结果表明该方法重复性较高。
4 讨论
一些农家品种如大毛花、小毛花、大鸡爪花、小鸡爪花、四季花、九丰一号、巨花一号等在山东、河南、河北等主产区广泛种植，并经无性系繁育和修剪成形成其他农家品种。种质差异是影响金银花质量和产量的重要因素，由于种质间植物外观形态差异不明显，且性状特征易随着产地变化而改变。本项目组建立了一套含有7个SSR标记及其SSSR9008219等7对引物的金银花种质鉴定标记，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱可区分来自全国各地的58个金银花种质。
在此基础上，本文针对其中亚特红蕾、九丰一号等8个种质，引入高分辨率熔解曲线优化种质鉴定方法。高分辨率熔解曲线可以在分子水平上准确地反映DNA片段的特征，可用于临床疾病的分子诊断与分型、植物遗传图谱构建、基因定位与标记辅助选择、突变检测及种质鉴定等研究[9]。高分辨率熔解曲线应用于植物种质资源鉴定研究，常用于检测SSR或SNP片段[10-12]，具有高通量、高灵敏度、操作简便、检测结果准确性和稳定性好以及无需设计探针，不需重新设计PCR引物等优点[13-14]。
HRM技术对于金银花的种质资源鉴定不受药材原植物生长发育阶段、供试部位等条件的影响，能较好地反映金银花不同品种的遗传多样性，并加以快速鉴定及准确区分。本实验筛选获得4种鉴别引物SSSR9008219，SSR9118060，SSR9122370，SSR9553121，在相应退火温度、循环数为35～40、DNA模板30～60 mg・L-1进行熔解曲线分析。采取归一化曲线，峰型熔解曲线及主成分分析3种方法相结合进行金银花种质鉴定。其中峰型熔解曲线可从Tm判断，最为简单，但分离度较低；主成分分析方法准确度最高，可鉴定样品量最大，归一化曲线易于数据库化，三者各有特点，可根据实际情况予以选择或相互结合已达到最佳效益。该方法可分别对一线红、亚特红蕾、九丰一号予以区分，其中亚特红蕾来源于红白忍冬、九丰一号为四倍体金银花，对金银花品种选育及后续开发利用具有重要意义。
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[责任�辑 吕冬梅]
