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摘要：以山羊小脑cDNA为模板，利用RT-PCR法扩增获得了SPRN基因完整编码区片段，将其连接到pMD19-T载体上，转化感受态JM109后，筛选并鉴定阳性克隆，通过序列测量，将序列正确的片段双酶切后连接到真核表达载体pEGFP-N1上。结果表明，成功构建了山羊SPRN基因完整编码区的真核表达载体。
关键词：山羊；SPRN基因；RT-PCR；真核表达载体
中图分类号：S827 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5618-03
SPRN基因编码Shadoo（简称Sho）蛋白，在结构上与PrPc类似。Sho蛋白约包括130～150个氨基酸，N端保守，含有最多6个富含Arg的四肽XXRG（X是G、A或S）重复的碱性区域和约20个AA与PrPc有非常高同源性的疏水区。与N端相比，C端不够保守，与PrP差异较大，包含一个糖基化位点，末端是GPI锚的信号肽。Sho蛋白氨基酸在不同物种中差异不大[1]。
Sho蛋白具有与PrPc相似的神经保护作用，因此认为SPRN基因是一个与TSEs有关的一个候选基因[2]。2007年8月发现了称为‘Shadoo’的朊病毒蛋白，证明了这种理论上的病毒蛋白真正存在，同时也观测到了这种病毒在朊病毒传染病过程中的意外改变，中枢神经系统中Shadoo蛋白具有类似于PrPc的保护性，降低了朊蛋白感染的水平[3]。这一发现可能会对于朊病毒蛋白的功能，朊病毒如何在动物之间进行传播，以及如何导致脑细胞死亡等问题的研究提供新的思路。SPRN基因在小鼠、绵羊、仓鼠、人、大鼠和牛脑组织转录水平高，在其他组织中也检测到表达[4-10]。本研究以小脑组织作为试验材料扩增构建了山羊SPRN基因的真核表达载体，为研究该基因的表达定位、抗体制备以及蛋白的功能提供了必要的条件。
1 材料与方法
1.1 材料
限制性内切酶、引物合成与测序、DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Trizol试剂、M-MLV反转录酶、T4 DNA连接酶、pMD19-T、Taq DNA聚合酶、GC Buffer Ⅱ、dNTPs购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 山羊小脑组织总RNA的提取 RNA的提取按照Trizol试剂说明书进行。
1.2.2 特异性引物的设计与合成 根据GenBank中山羊SPRN基因的序列，利用Prime Premier 5.0 软件设计引物，并在正向引物引入限制性Bgl Ⅱ酶切位点5′-GAAGATCTGAGGTCTCCTCCGTCCT-3′，在反向引物引入EcoRⅠ酶切位点5′-CGGAATTCCACAGGCCTACCGCA-3′。
1.2.3 山羊SPRN基因完整编码区的PCR扩增
1）cDNA第一链的合成。以提取的山羊小脑组织总RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行cDNA第一链合成：配制模板RNA 10 μL，oligo（dT）18 primer 5.00 μL，RNase free dH2O 15 μL的混合液；70 ℃保温10 min，冰浴2 min。短暂离心后分别加入10 μL 5×M-MLV Buffer，2.50 μL 10 mmol/L dNTP Mixture，1.25 μL Recombinant Ribonuclease Inhibitor，1.25 μL Reverse Transcriptase M-MLV和5.00 μL RNase free dH2O；42 ℃ 60 min，70 ℃保温15 min后冰上冷却。所得产物直接用于PCR。
2）PCR扩增。PCR反应总体积为20 μL，含10×LA PCR Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向和反向引物各1 μL（10 pmol/μL），DNA模板 1 μL，LA Taq DNA聚合酶 0.4 μL。混匀后瞬间离心，于PCR仪中进行扩增反应。PCR反应程序为：96 ℃预变性3 min；96 ℃变性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测并按照试剂盒说明书回收产物。
1.2.4 山羊SPRN基因与T载体的连接、转化、筛选与测序 将纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上。反应体系总体积为10 μL，其中Slution Ⅰ 5 μL，pMD19-T载体1 μL，纯化的PCR产物4 μL，16 ℃连接3 h。在-80 ℃冰箱取100 μL感受态细胞放置冰上，待融化后，将5 μL连接产物加入感受态细胞，在冰上放置30 min，42 ℃热激90 s，立即冰浴2 min，加入890 μL无抗生素的LB液体培养基，37 ℃振荡（180 r/min）1 h，离心（4 000 r/min，2 min），弃掉一部分上清液，取200 μL涂于预铺有IPTG和X-gal的含Amp琼脂平板上，37 ℃平放1 h后倒置培养过夜。
1.2.5 构建真核表达载体
1）pMD19-T-SPRN和pEGFP-N1载体的双酶切。总体积为50 μL，10×Buffer 5 μL，Bgl ⅡⅠ 2.5μL，EcoRⅠ 2.5 μL，质粒DNA 20 μL，去离子水20μL。37 ℃，酶切3 h。
2）pEGFP-N1-SPRN的构建。 取双酶切后的SPRN基因完整编码区片段5 μL，酶切后的pEGFP-N1 1 μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双蒸水2 μL，总体积为10 μL，混匀，于37 ℃孵育3 h，然后于65 ℃终止反应。取连接后的产物5 μL转化感受态JM109，筛选阳性克隆质粒，进行电泳和酶切鉴定。 2 结果与分析
2.1 山羊SPRN基因的PCR扩增与克隆测序
2.1.1 山羊小脑组织总RNA的完整性 利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性，结果如图1。从图1可以看到清晰的28S rRNA、18S rRNA两条主带以及较弱的5S rRNA带，表明所提取的总RNA完整性较好，纯度较高，可用于RT-PCR反应。
2.1.2 山羊SPRN基因的PCR扩增 利用RT-PCR扩增山羊SPRN基因完整编码区，产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果显示，得到了一条特异性条带，与预期片段大小一致，约为488 bp，扩增的特异性较强（图2）。
2.2 山羊SPRN基因重组真核表达载体pEGFP-N1-SPRN的酶切鉴定
利用琼脂糖凝胶电泳对酶切后的重组阳性真核表达载体pEGFP-N1-SPRN进行检测，电泳结果与预计的结果相一致，酶切片段大小分别为4 700 bp和488 bp，表明山羊SPRN基因完整编码区已成功地克隆到pEGFP-N1载体上（图3）。
3 讨论
经过对构建的真核表达载体测序，结果证明，所克隆的山羊SPRN基因完整编码区的序列是正确的。山羊SPRN基因完整编码区经双酶切后连接于pEGFP-N1载体上。pEGFP-N1全长为4.7 kb，构建的pEGFP-N1-SPRN载体长度约为5.2 kb，酶切鉴定结果表明，SPRN基因完整编码区成功克隆到了真核表达载体pEGFP-N1上，其在真核细胞中的表达为研究该基因的亚细胞定位与功能提供了必要的条件。
参考文献：
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（责任编辑 程碧军）
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