爱华网组织学切片制作体会与注意事项
阿力甫江·海力力
【摘要】学生亲自动手制作组织学切片、涂片，体会切片制作过程，并掌握相关技能，培养实践动手能力、创新能力并通过制作过程熟悉了HE染色石蜡组织切片（大鼠，兔）制作、血涂片制作的主要操作流程，总结出了一些相关学生制作切片中的注意事项。
【关键词】学生 动手实践 石蜡切片 HE染色 注意事项
在组织学老师海米提教授的立项，教导之下本班（本硕2010-2班）学生通过自愿报名参加的方式参加了此次组织学切片、涂片制作开放性实验。组织学标本制作是相关于组织学、胚胎学、病理学等基础课程的一项基本科学技能，在临床诊断中发挥着不可替代的作用。组织学实验教学的切片全是由老师准备好的，同学们对切片制作原理，切片观察中的三维思维方面存在很多的问题。通过参加此次相关标本切片制作这种简单的科研活动， 同学们对的书面知识有了一次巩固，体会了真正制作完美无瑕的切片也并非易事，让同学们理解了搞科研必备的责任心、细心、静心、创新的重要性，下面将主要谈讨在动手实践制作大鼠组织HE染色石蜡包埋切片的主要流程及注意事项。
一．取材
取材是实验的第一步也是实验成败的关键一步，取材小组2-3人为宜，动物麻醉后先开腹腔再开胸腔取相关组织。
注意事项：快速完整的去处组织尤为重要，取材刀刃剪刀要锋利，不能用镊子挤压，取义组织避免损伤周围组织，并要注意取一些组织前要结扎血管，做大鼠取材时组织尽量完整为宜， 取好组织要用流水冲洗组织力的凝血块、粪便等杂物。
二．固定
用10%福尔马林固定24小时以上，液体体积为组织体积五倍以上。固定后组织不易变形可以长时间保存使用，所以取材剩下组织要放到固定液中保存，以免浪费。固定好的组织用滤纸包裹并写进标签有利于下几步的操作和组织的鉴别。
三．脱水，透明
脱水是利用脱水剂将细胞内的水分置换出来以有利于有机溶剂的渗入过程，脱水是否彻底、时间是否适宜直接关系到组织能否充分透明、是否发脆。
脱水流程为上行梯度浓度酒精(75%,85%,90%,95%Ⅰ,95%Ⅱ,无水乙醇Ⅰ,无水乙醇Ⅱ)在95%乙醇和无水乙醇的脱水时间各3-4小时为宜，否则易发生切片发脆、出现裂纹、厚薄不均等现象。
透明流程是依次经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ 的过程，二甲苯Ⅰ待40分钟左右，二甲苯Ⅱ 时观察组织透明度因组织大小而异，透明时间不易过长一般总共不超过1.5个小时，否则切片发脆。
四．浸蜡
组织经透明后在融化的石蜡内浸渍的过程 。 石蜡温度以56-60℃ 为宜，蜡液分蜡Ⅰ、蜡Ⅱ 各待1.5小时，浸蜡时间控制不好会发生切片厚薄不均、出现皱褶、切片脱落等现象
五．包埋
将组织固定于蜡块中的过程 要注意蜡块大小、冻结速度、包埋工具清洁、
组织位置及方向。 官腔组织应竖直包埋，修去余蜡以保留周围2cm石蜡为标准，切面要平坦，靠近组织但避免损伤组织。包埋用石蜡旧蜡与新蜡的比列以1:3为宜
六．切片
切片是整个过程中最需要技术的也是问题集中出现的关键环节，
本班采取的方法是先用旧刀片修理蜡块，使组织暴露并出现带状连续蜡片时还新刀片继续切片操作，操作过程中应注意轮式切片机切片速度的控制，出现七八个连续的含组织蜡片时停止开始展片操作，切片时要注意切事先讨论好的切面
七．展片与捞片
把切下蜡片放入温水中展开。温度以45-52℃ 为宜。先用毛笔占取蜡片再用镊子夹蜡片一端，顺着平铺于温水液面，待组织与周围石蜡课明显鉴别并均匀召开后用镊子做分离操作，力度、 动作幅度要注意，镊子要干净干燥。再待1-2分钟组织完全展开后用事先准备好的载玻片（实验开始前泡在浓硫酸和高锰酸钾的混合液24小时以上，再用蒸馏水清洗，烘干）捞取组织，动作要迅速，组织在载玻片中的位置以染色液液面决定，本班是将组织捞在载玻片一端以达到充分染色的目的。
切片，展片过程中常出现的问题及解决
1．切片不成带状
① 调整切片刀的角度
② 重新包埋
③ 将蜡块放入冰箱中再迅速切片
2．切片厚薄不均
① 重新脱水包埋
② 检查切片机故障
③ 调整脱水，透明时间重新包埋
3.切片有褶皱
①放入冰箱中重新切片
②蜡片放入35%酒精中，再放入温水展片
八．烤片，脱蜡
放入60℃烤箱中进行烤片，取出放入二甲苯，下行梯度酒精至水，脱去石蜡，脱蜡不干净会影响其切片着色
九．染色，脱水
完成脱蜡的切片用流水清洗（低速，从无组织一侧流水）后放入以下溶液完成染色脱水
苏木精（5-8min）→1%盐酸（数秒，分化）→氨水（1min）→冲洗(5min) →伊红（5min）→冲洗（30s）→75%酒精（数秒）→85%酒精（数秒）→90%酒精（数秒）→95%酒精Ⅰ（1-2min）→95%酒精2（1-2min）→无水酒精Ⅰ（1-2min）→无水酒精Ⅱ（1-2min）→二甲苯Ⅰ（3-4min）→二甲苯Ⅱ（3-4min） 脱水是否彻底影响至切片质量。
十．封片
用二甲苯透明的切片迅速用中性树胶进行封片 注意事项：
①不能让二甲苯晒干，二甲苯为树胶溶剂，有利于封片步骤
②不能用手直接按压盖薄片，防止有指纹出现，应用一个干净载玻片的等工具均匀按压盖薄片至树胶完全沾满盖薄片面积
③封后的切片不宜马上放到切片夹，易造成盖薄片移位
④ 切片放到烤箱中24小时以上烘干后可避光保存
总结
此次试验中本班同学积极参加，在教师的指导下查阅有关的文献，和老师一起做了实验前准备工作，并利用周末等课余时间完成了实验。通过此次实验充分体会了一个科研项目从立项到完成的过程，学会了科研论文的基本书写规范，试验中采取的教学方法更是激发了我们自主学习的兴趣，提高了动手能力，巩固了书面知识，体会了要想成为现代一名合格的长年制医学生并非易事，需采取不同的学习方法，应用先进资源，主动与老师联系，注意创新，实践动手能力的培养。
参考文献
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