爱华网构巢曲霉在应答与金合欢醇诱导压力下蛋白质组学分析-推测担任疏水蛋白角色
摘要：类异戊二烯金和欢醇在治病酵母中作为细菌密度感知系统分子，也在一些丝状真菌中表现为生长抑制。为了更深的了解金合欢醇的抗真菌机制，就做了构巢曲霉在金合欢醇诱导下的的双向电泳分析。我们发现抗氧化酶和参与蛋白质折叠和降解的蛋白质的增多。一个显著的发现一个貌似疏水蛋白的蛋白DlpA在很大程度上上调。表达分析表明DlpA参与氧化，渗透性，和冷压力的应答。我们也发现dlpA的表达受MAP蛋白激酶Sak/HogA调控。构巢曲霉野生型和dlpA敲除菌株测试发现DlpA对于休眠分生孢子的抗热和抗氧化有作用。此外，此生代谢产物杂色曲霉素在两株菌中都缺少。我们的研究证明了构巢曲霉在金合欢醇的调节下的复杂应答和金合欢醇可诱导休眠分生孢子产生疏水蛋白相似物以抵抗外界的氧化和高温。
引言：
金合欢醇是非循环倍半萜烯醇，是真核生物中第一个被认识的感应分子。它是由人类致病菌白色念珠菌产生，抑制酵母菌丝的生长和生物膜的形成。此外，金合欢醇在许多种微生物、哺乳动物和植物细胞中变现出作用，它能够抑制细菌和真菌使他成为应用于保健有趣的混合物。他可以促进细胞的凋亡和抑制各种的细胞株的癌化。同样的影响在酵母和真菌中发现，说明具有保守的分子机制和靶标。在构巢曲霉中外部加上金合欢醇和与白色念珠菌一起培养的效果一样，表面都出现凋亡的特征。此外，同一个作者还给出的金合欢醇诱导细胞凋亡是通过G蛋白异原三聚体的调节而起作用的。G蛋白负调控因子FlbA的敲除造成G蛋白a亚基的超活化和增加对金合欢醇的抗性敏感。改变了cAMP的水平表明在构巢曲霉和黑曲霉中的金合欢醇参与G蛋白依赖性的途径。
最近的研究发现对金合欢醇敏感的更深层次的分子目标和信号途径。发现了一些线粒体相关蛋白，可以使金合欢醇诱导降低从而抑制细胞的凋亡。人类病原菌烟曲霉表明金合欢醇抑制CWI信号途径的活性。金合欢醇在构巢曲霉和烟曲霉中作用的途径显然不同。烟曲霉MAP激
酶MapA的敲除突变表现出对金合欢醇的敏感增加，然而构巢曲霉的mpkA的突变则表现出对金合欢醇更大的抗性。此外，在烟曲霉中，金合欢醇对菌丝的顶端形态也有影响。金合欢醇在转录水平的影响已经很清楚了，但是在蛋白质组水平的影响还不是很清楚。所以为了研究模式生物构巢曲霉在蛋白质水平对金合欢醇的应答作用，就做了一个双向电泳。
结果：
1、构巢曲霉应答与金合欢醇的蛋白组分析比较
我们的目的是研究丝状真菌构巢曲霉在蛋白质组学水平上对金合欢醇的的应答。经试验，金合欢醇在50微摩尔每升的浓度是最适合实验的浓度。高浓度抑制生长，低浓度对甚至没有什么影响。尽管50微摩尔的浓度轻微的影响孢子的萌发的和孢子形成，菌丝生长减少。经过一系列时间的的实验，发现在三小时的时候构巢曲霉菌丝的蛋白组成展现出了最大的差异。野生型菌株R21在液体培养基中培养长成球形后，用50毫摩尔金合欢醇处理3个小时，以乙醇作为对照。提蛋白双向电泳。
通过蛋白指纹图谱找出43种蛋白质发生改变，如表一。为了研究推测的应答与金合欢醇的分子靶标和中和金合欢醇毒素的机制，做了更详细的关于DlpA的功能测试
2、dlpA基因表达的调节
基于植物疏水蛋白的特征，对适应于渗透压力和冷压力条件下的氨基酸组分进行分析显示，具有高水平的甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基，但是很少有半胱氨酸和色氨酸残基，这就赋予了蛋白质很高的疏水性。此外在真菌疏水蛋白中发现重复的氨基酸序列Asp-Pro-Arg (DPR)。烟曲霉中，这三个疏水蛋白类似蛋白最近被发现为压力保护元件。构巢曲霉蛋白DlpA在我们的蛋白组学研究中发现包括真菌疏水蛋白的模式特征。双向电泳显示，DlpA呈现出过早应答，直到大量增加出现稳定加上金合欢醇。3小时后达到最大。然后逐渐减少。如图2A。金合欢醇的一些立体异构体可以影响dlpA的表达，这表明这些物质对构巢曲霉的作用机制是相似的。
由于DlpA序列和植物和真菌的疏水蛋白相似，是否DplA具有疏水蛋白的功能。通过RNA印记分析，我们发现用1摩尔的山梨醇或者1摩尔的氯化钠渗透和低温诱导mRNA增加至一个稳定的水平。然而，
除了细胞壁压力没有其他压力诱导则不显示很大的影响。此外，dlpA的mRNA在新形成的休眠分生孢子中保持一个较高的水平，但是在萌发时或是菌丝生长时会降低。
3、在构巢曲霉中dlpA反义RNA的表达
为了分析DlpA对于构巢曲霉抵抗金合欢醇的作用，于是进行了基因敲除。敲除菌株的特征呈现出令人费解的特征，我们的理解是基因敲除诱导假定的补偿机制。值得一提的是敲除菌株表现出菌落直径变小和野生型菌株相比。这个表型能够在渗透压或三十度下培养的情况下得到部分改善。在低于20摄氏度的情况下变现出比野生型生长更好的态势，在42摄氏度的情况下没有明显的生长不足出现。敲除菌株没有表现出对金合欢醇的敏感性，可能的机制抑制DlpA的功能，也就是掩盖金合欢醇毒性的机制。将dlpA的反义RNA转化到野生型R21中，用DNA杂交检测到反义RNA的存在。在野生型菌株中dlpA基因有微弱的表达在加入盐酸强力毒素后的三十分钟，但是在之后的时间里就没有表达了。但是，用浓缩的盐酸强力毒素对野生型R21的生长没有什么明显的生长，然而与没有毒素的情况下相比孢子形成作用减少了百分之六十。金合欢醇的存在导致有反义RNA菌株完全失去孢子形成作用，但是不影响菌落直径生长，和dlpA敲除菌株一样。但是，有反义RNA诱导的菌株在抗真菌毒素的情况下损害更大。
4、在休眠分生孢子中DlpA的功能和调控
在休眠分生孢子中高水平DlpA基因的敲除显示在这个阶段起一个非常重要的通讯蛋白的作用。由于在有渗透压的情况下dlpA基因高表达，所以我们分析它的调控也在渗透压控制MAP激酶途径。为了这个目的，突变株缺乏HogA MAP激酶和敲除突变菌株在正常压力下的应答调控因子AtfA，是Hog途径的一个下游组分，在100微摩尔金合欢醇的条件下30分钟发生改变。RNA印记分析显示缺乏金合欢醇诱导可以使dlpA基因表达在atfA和hogA删除的菌株中。这个结果表明，HogA MAP激酶途径参与dlpA基因的表达调控。
5、DlpA是杂色曲霉素生物合成所必须的
在液体培养基中培养三天，上层漂浮物和dlpA突变菌株的菌丝着色与野生型相比较浅。为了验证是否dlpA基因的敲除减少了色素的产生或者其他的次生代谢产物，我们做了HPLC分析，结果令人吃惊的是基因的敲除不能产生次生代谢产物杂色曲霉素在实验条件下，然而，另外一种次生代谢产物terrequinone A却可以检测到。尽管存
在反义RNA的菌株在着色方面没有什么异常，但是在doxycycline的处理下也很难检测到杂色曲霉素。为了确定在转录水平两个菌株的杂色曲霉素产生的钝化作用，我们提取了杂色曲霉素合成途径基因族中的三个基因(stcU, stcE and aflR)的mRNA表达水平，结果显示和构巢曲霉的野生型和没有用doxycycline处理的存在反义RNA的菌株这三个基因的表达量很大程度的下降。与之相似的，dlpA敲除菌株这一个基因群没有基因表达。
讨论：
通过双向电泳可以发现经过金合欢醇处理过的构巢曲霉有43中蛋白质的表达发生了变化，这些蛋白涉及糖酵解，蛋白质的折叠，以及氨基酸代谢等功能。有报道称在白色念珠菌中金合欢醇处理24小时涉及线粒体呼吸的下游基因和蛋白质折叠的上游基因能够抵御氧化作用的压力。在我们研究金合欢醇的的作用中，线粒体中心蛋白细胞色素c还原酶复合体的减少伴随着谷胱甘肽氧化酶的增加。假说得到验证，金合欢醇的靶标线粒体，细胞内谷胱甘肽耗尽，结果造成氧化压力。此外，在构巢曲霉中诱导未折叠蛋白的应答。这条途径可以激活内质网中错误折叠蛋白的积累。我们发现一些泛素激活酶和一些细胞质的热激蛋白表现出上调。此外，可以检测到Cdc48和Nap1两种蛋白的表达量上调，可能有其他的特别是DNA损伤方便的功能。而且，Cdc48在酿酒酵母中参与细胞凋亡的进程。在构巢曲霉中的上调表达，表明对金合欢醇的UPR调节压力应答。
一个令人吃惊的结果是疏水蛋白类似蛋白大量的增加，没有变现出任何的功能。表现出在金合欢醇的诱导下在转录水平和蛋白质水平两方便都有增加。此外。我们在低温下和渗透压下dlpA的表达量与在UPR压力下相同。尽管他们的特殊功能不是完全清楚，表明他们帮助细胞膜蛋白质抵抗低温造成的损害。这表明金合欢醇膜上的靶目标诱导疏水蛋白DlpA的生物合成。然而直到现在这个蛋白的家族在真菌中也不是很清楚，最近的研究表明，烟曲霉中这三个疏水蛋白可以帮助抵抗高ph,低温，渗透压等恶劣条件。Blast分析显示烟曲霉中dlpA和构巢曲霉中dlpA同源。
尽管在构巢曲霉中的疏水蛋白基因的敲除是不致死的，我们发现DlpA在抵抗外界压力方便起着非常重要的作用。值得注意的是，两个菌株杂色曲霉素的产生都不足。这表明改变的PkaA活力水平在存在反义RNA的菌株中下游的激活因子，直到杂色曲霉素生物合成受到
抑制在实验条件下。然而，在自然产生的正负调节因子生物合成之间的相互作用不是完全的清楚。可能的在真菌细胞中，疏水蛋白DlpA拥有更多普遍的功能。基于DlpA对于卡泊芬净的敏感性增加了，DlpA 可能对细胞壁的稳定性起作用。相比较，DlpA敲除菌和存在反义RNA的菌株都没有表现对其他细胞壁干扰素有很高的敏感性。所以，更可能的是DlpA和压力影响的蛋白相互作用包括膜相关的信号组分等。值得注意的是他与烟曲霉中具有相似功能的疏水蛋白之间的关系。研究表明在烟曲霉中Rho1和Rho3两个家族的GTP酶受金合欢醇的影响。直到Rho GTP酶发现为细胞骨架动力蛋白的调节子，表明它们在细胞壁开始压力下错位，导致细胞骨架的改变和最后菌丝顶端的膨大。这就引起推测疏水蛋白参与这个机制，直到Rho1表现出和β-1,3葡聚糖合成酶复合体相互作用。DlpA复合体对金合欢醇反应还需更深层次的研究，由于敲除菌株缺乏对金合欢醇的敏感度而导致综合的反应。
总结：
蛋白质组学的研究报道，确定和拓展前期的研究表明金合欢醇的靶标是线粒体和诱导氧化压力蛋白和未折叠的蛋白在构巢曲霉中产生应答。开始我们展示了疏水蛋白相似蛋白，如DlpA，在金合欢醇的诱导下而高表达。DlpA 基因的敲除导致分生孢子对氧化和温度压力的敏感性增加，潜在的疏水蛋白相似蛋白可以让分生孢子对压力产生抗性。我们更深层次的研究显示一个不适当的信号在dlpA突变株中导致杂色曲霉素基因群的沉默，这个结果表明蛋白质组学可以帮助分析基因和蛋白承担的生物学的角色。
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