爱华网关键词：硅；水稻；重金属；正交胁迫；丙二醛（MDA）
中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5771-06
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.012
Effects of Silicon on Malondialdehyde Content in Rice under the Orthogonal Stress of Cd，Pb，Cu and Zn
WANG Xiao-ling1，2， LIU Teng-yun1，2， XING Xue-jun1， LI Qian3， GAO Zhu1
（1.Institute of Biological Resources，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330096，China；2.Jiangxi Key Laboratory of Poyang Lake，Nanchang 330096，China；3.Institute of Enviromental Engineering，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）
Abstract： Pot experiments with an orthogonal stress experimental design L9（34） were conducted to study the effects of organic/non-organic silicon solution spraying on the malondialdehyde （MDA） content and its change trend in rice leaves under the heavy metals pollution. Results showed that MDA content in rice leaves increased significantly when soil polluted by heavy metals； MDA content gradually increased with the increase of heavy metals concentration； MDA content showed the trend of first increasing then decreasing with the prolonging of growth period. Effect order on rice leaves of different heavy metals was Cd>Pb>Cu>Zn. The rice leaves treated with organic silicon had the lowest MDA content（565.85 μmol/g FW），and followed by those treated with non-organic silicon（565.85 μmol/g FW）. The highest content was found in those without silicon treatment（611.73 μmol/g FW）. And the differential of MDA contents in leaves with different treatment was significant（P Key words： silicon； rice； heavy metals； orthogonal stress； malondialdehyde （MDA）
水稻是中��第一大、世界第二大粮食作物。但是近年来，随着工矿业“三废”排放和过量施用化肥[1]，稻田土壤重金属超标率较高。2011年，农业部对湖北、湖南、江西、四川四省重点污染区的88个县15.8万hm2水稻田调查，超标面积10.7万hm2，超标率67.8%。当稻田土壤重金属积累到一定程度时，即可通过迁移转化，引起糙米中重金属含量提高，产品质量下降，进而通过食物链进入人体富集[2，3]，也可经水、空气、生物等介质传递至人体暴露部分[4，5]，对人类健康产生威胁，诱发许多疾病发生[6，7]。
江西省矿产资源丰富，德兴铜矿是亚洲第一大露天铜矿，大余县又具有“世界钨都”之称，矿业开发引起周边地区土壤、河流、农作物中部分重金属含量超标，附近居民致癌风险明显提高[8-10]。德兴铜矿酸性废水中重金属元素引发矿集区下游几个村的几千顷良田变成了荒地[11-14]；大余县钨矿开采造成约140 km2稻米镉含量严重超标，成为全国16个“镉米”产地之一[15，16]。且随着“毒大米”事件的相继发生，重金属污染水稻的安全性问题一直受到高度关注[17]。大量研究集中在水稻土重金属污染特征分析[18]、污染风险评价[19]、低积累品种筛选[20，21]、重金属污染胁迫研究[22]等，但是水稻对重金属胁迫影响的机制因水稻品种和重金属元素种类不同而存在的差异，目前尚未定论，无法从科学的角度对每个水稻品种提出一种确定的方法降低重金属污染带来的毒害。 重金属胁迫会破坏水稻叶片膜完整性，细胞膜透性提高，活性氧含量增加，膜脂过氧化作用加强，其产物丙二醛（Malondialdehyde， MDA）积累量增加，导致水稻光合速率下降，光合功能衰退，叶片提前衰老或死亡[23，24]。有研究表明，使用外源硅可缓解水稻对重金属的吸收、转运、分布，可以提高水稻抗氧化系统活性，增强其抵御重金属胁迫的能力[25-28]。因此，选用江西省种植的三系杂交晚稻H优518，通过盆栽试验，研究重金属Cd、Cu、Pb、Zn正交胁迫下，不同种类外源硅处理对水稻叶片MDA含量和生长过程中MDA变化趋势的影响，以期为缓解复合重金属胁迫对水稻产生的毒害提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试土壤 供试土壤pH为5.8，其有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾的测定方法分别为重铬酸钾容量法、半微量开氏法、硫酸-高氯酸消煮法、NaOH熔融-火焰光度计法、碱解扩散法、碳酸氢钠法和醋酸铵-火焰光度计法，含量分别是24.65、1.29、0.72、12.94、68.73、23.14、182.93 mg/kg。
1.1.2 水稻品种 供试水稻为三系杂交晚稻H优518。选取子粒饱满、大小均匀的水稻种子，先用10%的H2O2消毒10 min，再用去离子水冲洗3～5遍，均匀放入保持湿润的珍珠岩中催芽生长15～20 d，至4～5叶期，挑选生长健壮及生长高度一致的水稻幼苗，备用。
1.1.3 试验试剂 试验处理的试剂为分析纯 Pb（NO3）2、 CdCl2・H2O、 CuSO4・5H2O、 ZnSO4・7H2O、（C2H5O）4Si、 Na2SiO3・9H2O， 浓度分别以Pb2+、 Cd2+、Cu2+、Zn2+、Si4+计，其中（C2H5O）4Si为有机纳米硅源，Na2SiO3・9H2O为无机硅源。
1.2 方法
试验于2014年8～10月在江西省科学院温室大棚进行。用5 L塑料桶，每桶装土5.0 kg。土壤Cd、Pb、Cu、Zn复合污染处理，试剂均溶于水后加入土壤，每桶添加复合肥7.5 g，每盆土泡水搅匀，待风干后再次泡水拌匀、风干，反复3次，使土壤熟化，3周左右。8月1日移栽，每桶定植4株水稻，于10月14日收获。
1.2.1 土壤和水稻处理方法 根据土壤环境质量标准GB 15618-2008，土壤无机污染物的环境质量二级标准值，当农用地水田pH>5.5～6.5时，总镉、总铜、总铅和总锌的标准值分别为0.30、50.00、80.00、200.00 mg/kg。因此，土壤胁迫处理分为3个水平，一是标准值，二是高于标准值的50%，三是高于标准值的100%，并按照L9（34）正交表进行4因素3水平试验处理，因素水平见表1。
水稻处理方法有3种：①无硅处理：生长过程中，水稻不经过任何处理；②有机硅处理：生长过程中，用5 mmol/L有机纳米硅源（C2H5O）4Si��施水稻叶面；③无机硅处理：生长过程中，用5 mmol/L无机硅源Na2SiO3・9H2O喷施水稻叶面；试验设置对照（CK），即土壤和水稻均不经过任何处理。
1.2.2 硅源使用方法 使用当天配制无机硅和有机硅试剂，摇匀后，添加适量洗衣粉，于上午8点之前喷至水稻叶片上下表面，均匀挂湿。于移栽10 d缓苗后（8月11日）进行第一次喷施；分蘖期（9月1日）进行第二次喷施，抽穗开花期（9月23日）进行第三次喷施。
1.3 样品制备及测定
1.3.1 样品制备 分别于移栽当日、喷施硅源24 h后及收获当日采取水稻无损伤叶片，用去离子水清洗干净，吸干表面水分，剪碎混匀。首先称取0.2 g样品于10 mL离心管中，加入10%的三氯乙酸溶液8 mL，4 000 r/min离心10 min；然后吸取4 mL上清液于10 mL离心管中，再加入4 mL 0.67%的硫代巴比妥酸溶液，沸水中加热15 min，冷却后，4 000 r/min离心5 min；最后收取上清液，用于丙二醛（MDA）含量测定。
1.3.2 样品测定与计算 MDA含量测定采用改进的硫代巴比妥酸法（TBA）[29]，分光光度计测定其在450、532、600 nm下的吸光度。
MDA含量计算公式如下：
MDA浓度C（μmol/L）=6.452×（D532-D600）-0.559D450
MDA含量（μmol/g FW）=C×V/W
其中，V为提取液体积，W为样品鲜重。
1.4 数据处理与分析
采用Excel 2007进行图表制作，SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，用Duncan新复极差法（DMRT）分析不同处理的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 硅对水稻MDA含量的影响
硅对正交胁迫下水稻叶片MDA含量影响的结果（表2）为缓苗后、分蘖期、抽穗开花期和收获期水稻叶片MDA含量的平均值。结果表明，经有机硅处理的水稻叶片MDA总量（504.63 μmol/g FW）最低，无机硅处理（565.84 μmol/g FW）次之，无硅处理（611.73 μmol/g FW）总量最高。随着重金属胁迫浓度的升高，有机硅和无硅处理水稻叶片MDA总量分别由633.11 μmol/g FW和779.83 μmol/g FW逐渐升高至706.97 μmol/g FW和840.96 μmol/g FW，分别增加了11.67%和7.84%；而无机硅处理随着重金属胁迫浓度的升高，水稻叶片MDA总量升高，当超过一定浓度时MDA总量开始下降。
进一步根据正交试验的特性和MDA含量结果（表2）显示，有机硅处理KCd1、KCu1、KPb1、KZn2，无机硅处理KCd3、KCu2、KPb3和KZn1，无硅处理KCd1、KCu1、KPb2、KZn3水稻叶片MDA总量最小，表明在Cd1Cu1Pb1Zn2、Cd3Cu2Pb3Zn1、Cd1Cu1Pb2Zn3重金属组合胁迫范围内，水稻分别经有机硅、无机硅和无硅处理后，可明显抑制叶片MDA含量的增加。同时，通过极差Rj值判断各因素对MDA含量影响的结果表明，有机硅处理、无机硅处理和无硅处理的各因素对水稻叶片MDA含量影响的主次顺序分别是Cd>Cu>Pb>Zn、Cd>Pb>Zn>Cu、Cd>Pb>Cu>Zn。可见，重金属Cd的含量是影响水稻叶片MDA含量的主要因素。 方差分析（表3）显示，有机硅、无机硅和无硅处理3种方式对水稻叶片MDA含量的影响差异均达到极显著水平。其中，在不超出土壤环境质量标准GB 15618-2008中土壤无机污染物的环境质量二级标准值时，即有机硅处理的1号水稻叶片MDA含量极显著低于其他处理；且2号、3号、6号处理间叶片MDA含量差异不显著，却极显著低于4号、5号、7号、8号处理。无机硅处理的1号、3号、7号、8号之间，以及无硅处理的1号、4号之间叶片MDA含量差异不显著，但极显著低于其他处理。由此表明，土壤复合重金属在超出环境质量二级标准值时，水稻叶片MDA含量升高，且土壤重金属Cd2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+组合在4号处理范围内（0.45、50.00、120.00、300.00 mg/kg）经有机硅和无硅处理，可明显降低水稻叶片MDA含量，而在3号处理范围内（0.30、100.00、160.00、400.00 mg/kg）经无机硅处理可明显降低MDA含量。
2.2 硅对水稻MDA变化趋势的影响
根据以上有机硅、无机硅和无硅处理的MDA含量变化趋势分别选择3号和4号处理进行分析。图1水稻叶片MDA含量变化趋势表明，土壤受重金属污染后，水稻叶片MDA含量明显升高；水稻叶片喷施有机硅或无机硅溶液后，可明显降低MDA含量。CK和无硅处理水稻叶片MDA含量在缓苗期明显降低，分蘖期无硅处理MDA含量迅速增加到最大，而CK处理MDA含量缓慢增加，抽穗开花期达到最大，可见土壤在重金属胁迫下，破坏了水稻叶片保护系统，MDA含量在缓苗后明显增加。有机硅和无机硅处理的水稻叶片MDA含量增加比较缓慢，抽穗开花期时MDA含量上升到最大，成熟期MDA含量逐渐降低，且有机硅处理的水稻叶片MDA含量始�K低于无机硅处理，表明土壤在重金属胁迫下，水稻叶片喷施有机硅溶液可明显降低MDA含量，有利于维持水稻叶片保护系统平衡。
3 小结与讨论
植物在逆境环境中，遭受氧化胁迫发生膜脂过氧化作用的产物MDA，MDA含量反映了植物细胞膜脂过氧化程度以及对逆境条件反应的强弱[30，31]。本研究中水稻叶片MDA含量随着Cd、Cu、Pb、Zn复合重金属污染浓度升高而增加，叶片细胞膜透性增强。孙健等[32]研究认为，随着Cd、Pb、Cu、Zn、As复合重金属污染浓度的增大，水稻幼苗MDA含量迅速增加，且呈现出明显正相关性，与本研究结论一致。水稻品种差异也会造成MDA含量累积的显著差异。何俊瑜等[33]和Wu等[34]研究均表明，耐受基因型水稻品种在重金属胁迫下能维持较高的活性氧清除能力，适应和抵抗重金属毒害，故比相对敏感的基因型水稻品种累积的MDA含量要少。章秀福等[35]研究则随着土壤Cd浓度的增加，MDA含量先下降后上升，且MDA含量随生育期一直增加。与本研究水稻随着生长时期的延长，MDA含量呈现先升高后下降的趋势的结论有差异。可见，不同浓度重金属污染都可提高水稻细胞膜透性，对细胞产生毒害作用，而毒害作用的程度，则与污染的重金属种类和水稻基因型差异有关。
土壤重金属污染是指土壤中铜（Cu）、铅（Pb）、锌（Zn）、锡（Sn）、镍（Ni）、钴（Co）、锑（Sb）、汞（Hg）、镉（Cd）和铋（Bi）10种金属元素含量累积超过标准限值，对动植物和人类造成危害[36]。镉是生物毒性最强的重金属之一，中国每年由于土壤Cd污染导致的Cd超标农产品达14.6亿kg[37]；铅锌矿周边土壤中经常富集的Pb、Zn、Cu等重金属以及类金属元素As含量往往超过限定值的几十倍甚至几百倍[38]，各重金属对潜在生态危害的顺序为Cd>Pb>As>Cu>Zn>Cr[39]。目前，有关重金属污染对水稻生理特性影响的研究大多集中在单一重金属或有限的二、三种重金属，而对4种以上重金属污染的报道相对较少[40，41]。本研究通过比较Cd、Pb、Cu、Zn 4种复合污染重金属对水稻MDA含量的影响顺序是Cd>Pb>Cu>Zn，表明复合污染条件下，Cd是影响水稻叶片MDA含量的主要贡献因子，复合污染条件下，Cd对水稻生理生长和人类健康造成的风险最大，这与大多研究者认为的结论一致[42]。
硅是地球上仅次于氧的最为丰富的元素，也是植物体内最丰富的无机元素之一，硅能提高植物对重金属的抗性已是不争的事实[43]。大量研究表明，硅通过缓解植株体内重金属毒害的代谢机制以及对抗氧化酶系统的调控作用，减少体内重金属的积累，提高植物抗重金属胁迫的能力[44]。张翠翠等[45]通过施硅处理显著降低了水稻植株MDA含量，提高了对重金属的抗性；且随着重金属胁迫时间的延长，硅的缓解效果受到一定限制。这与本研究结果中的硅处理在水稻抽穗扬花期前较成熟期对叶片MDA含量影响较大，缓解重金属胁迫效应较好的结论相符。同时，本研究结果表明，喷施有机硅处理的水稻叶片MDA含量最低，对重金属胁迫缓解的效应最好，无机硅处理次之。这与黄崇玲等[46]、王世华等[47]研究认为的有机硅处理水稻可显著缓解重金属毒害效果的结论相符。但是有关有机硅处理浓度和喷施时间对缓解水稻重金属污染的效果还有待进一步研究。
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