爱华网第40卷
2012年7月 分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry 第7期1037~1042
:/DOI10.3724SP.J.1096.2012.11206
全血直接扩增结合焦磷酸测序法测定
亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性
刘云龙1 陈之遥2,3 武海萍2 周国华*
12,3(中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009)2
3(南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院)药理科,南京210093)(华东医学生物技术研究所,南京210002)
摘 要 亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性与临床常用抗肿瘤药物甲氨
喋呤及氟尿嘧啶的作用密切相关,对这两个位点多态性的检测能指导临床合理用药。为进一步缩短检测时
间,降低检测成本,本研究建立了基于全血直接PCR的焦测序检测方法,采用“HpHBuffer”直接扩增全血模
板,仅需1mL全血样本即可对两个位点进行高效扩增。扩增产物经碱变性法制备单链模板后进行焦磷酸测
序,经过条件优化,仅需5mL扩增产物和1mL微球即可完成高灵敏的焦测序反应。为验证方法的准确性,检
测了12例临床样本,均能正确检测两个位点的基因多态性。本研究为临床基因多态性检测提供了一种操作
简便,耗时短,成本低,准确度高的方法,本方法可用于指导甲氨喋呤和5氟尿嘧啶的个体化用药。-
关键词 亚甲基四氢叶酸还原酶基因;基因分型;全血直接扩增;焦磷酸测序
1 引 言
亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)基因的编码产物亚甲基四氢叶酸还原酶为叶酸代谢的限速酶,可催化5,10二甲基四氢叶酸向5甲基四氢叶酸的转化。该基因的--677C>T和1298A>C遗传多态性会影响酶活性[1],从而导致一系列反应。MTHFR基因多态性与甲氨喋呤的毒副作用存在显著相关性。研究结果表明,677位突变型患者在使用甲氨喋呤治疗时的毒性反应比野生型患者严重得多[2,3]。MTHFR的多态性也会影响5氟尿嘧啶的临床疗效,677位突变型患者较-野生型患者可取得更好的化疗结果,1298位突变型患者的化疗效率也明显优于野生型患者[2,4]。检测MTHFR基因677C>T和1298A>C多态性可作为化疗疗效和毒副作用的良好预测指标。
目前,对于单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)的检测技术主要包括基于等位基因特异性杂交的Taqman探针技术[5],分子信标技术[6]等;基于核酸内切酶的限制性长度多态性技术[7],引物入侵分析技术[8]等;基于高度特异性DNA连接酶的寡核苷酸连接分析技术[9];基于引物延伸的直接检测中得到应用[11]。焦磷酸测序法[12~14]由于其良好的定量性能,无需电泳或荧光标记,易于自动化等优点已成为SNP检测最主要的方法[15~18]。但是,传统的焦磷酸测序法需要经过DNA提取,PCR扩增,单链制备等前期准备工作,耗时长,且成本测序法和等位基因特异性延伸法[10]等。但这些方法大多操作复杂,成本昂贵,因而没有在大规模SNP较高,难以满足临床检测快速,低成本的要求。本研究利用自主研发的“HpHBuffer”对MTHFR基因进行全血直接扩增[19],省去基因组DNA的提取过程;经过条件优化,仅需要少量PCR产物和微球制备单链就可以完成焦磷酸测序反应,达到对MTHFR基因677C>T和1298A>C两个SNP位点的快速,低成本检测。2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1024收稿;20120211接受 2011----((本文系国家自然科学基金(面上项目)No.20975113)和江苏省科技支撑计划(社会发展)No.BE2010604)资助
*Email:ghzhou@nju.edu.cn-;EDC10型基因扩增仪(东胜创新生物科技有限公司)GeneSpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日本Naka-
;;。Instrument公司)小型焦磷酸测序仪(日本Hitachi公司)GenGenius凝胶电泳成像仪(美国Syngene公司)
三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase),单链结合蛋白(Singlestrandedbindingprotein,SSB)和Kle---;now聚合酶为实验室自表达;TaqDNA聚合酶,500bpDNALaddermarker(日本Takara公司)聚乙烯吡
;咯烷酮(PVP),QuantiLum?重组荧光素酶(美国Promega公司)腺苷三磷酸双磷酶Apyase,腺-Ⅶ(-Ⅶ)
(1thiotriphosphate),dATPS),三磷酸脱氧胞苷酸(2Deoxycytidine5triphosphate,dCTP),三磷酸脱氧-α′--′-
,phate,dTTP)购自美国AmershamPharmacia公司;其它试剂均为分析纯;实验用水均为灭菌双蒸水。
所有引物由上海Invitrogen公司合成,具体引物名称及序列见表1。
表1 检测亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)基因多态性的引物
Table1 Sequencesofprimersusedforgenotypingmethylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)gene
位点Sites引物Primers
677上游引物Upstreamprimer(677F)-引物序列Primersequences53′-GACTGTCATCCCTATTGGCAGGTT-′5BiotinTGGGAAAGA3′--CCCTCACCTGGA-′5GAGAAGGTGTCTGCGGGAG-3′-′5GGTGGCACTGCCCTCTGT-3′-′,苷5磷酸硫酸(Adenosine5′APS),牛血清蛋白(Bovineserumalbumin,BSA)购自美-′--phosphoricacid,;国Sigma公司;SepharoseBeads(美国GEHealthcare公司)硫化三磷酸腺苷(2Deoxyadenosine5Oα-′--′--鸟苷酸(2Deoxyguanosine5triphosphate,dGTP),三磷酸脱氧胸腺苷酸(2Deoxythymidine5triphos′--′-′--′--引物长度Primerlength(nt)242119
18
21
19产物长度Ampliconlength(bp)222677C>T677下游引物Downstreamprimer(677R)-677测序引物Sequencingprimer(677Seq)-1298A>C
1298上游引物Upstreamprimer(1298F)-1298下游引物Downstreamprimer(1298R)-1298测序引物Sequencingprimer(1298Seq)-5BiotinCCACTCCAGCATCACTCACTT3′---′5GAGGAGCTGACCAGTGAAG-3′-′256
2.2 实验方法
氯仿法2.2.1 基因组DNA提取及MTHFR基因的常规PCR扩增 留取外周全血样本1mL,采用酚-提取基因组DNA,再以TE缓冲液溶解。实验用DNA模板均以紫外分光光度法测定其浓度及纯度,并
以TE缓冲液调整终浓度为20~100mg/L。PCR反应体系包括10×buffer5mL,MgCl22mmol/L,dNTP200mmol/L,上下游引物各0.4mmol/L,DNA模板2mL,Taq酶1.25U,加水补充至50mL。PCR反应条
2.2.2 MTHFR基因的全血直接PCR扩增 留取添加不同抗凝剂的外周全血样本1mL,直接用于MTHFR677C>T,1298A>C位点的目的片段扩增。PCR反应体系包括用于全血PCR反应的HpHPCR件:94℃预变性5min;94℃,30s,55℃,30s,72℃,30s,35个循环扩增;72℃延伸7min。Buffer5.35mL,dNTP200mmol/L。上下游引物各0.4mmol/L,Taq酶2.5U,加水补充至50mL,混匀,12000g离心5s后加入全血模板1mL。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;35个循环扩增;72℃延伸7min。
2.2.3 高灵敏度焦测序反应 采用上述全血直接扩增方法对MTHFR基因677C>T和1298A>C两个位点进行扩增,取1~10mLPCR产物加入1~5mL链亲和素包被的琼脂糖微球,利用碱裂解法制备固EDTA,10mmol/LMg(Ac)0.1%BSA,1mmol/LDTT,2mmol/LAPS,0.4g/LPVP,0.4mmol/LD虫萤光2,-
素,2mmol/LATPsulfuryiase,1.6U/mLApyase18U/mLKlenow聚合酶,适量萤光素酶。测序引物后--Ⅶ,;。序列分别为MTHFR677C>T:53MTHFR1298A>C:53′-C/TCGATTT-′′-A/CAAGTGT-′相单链,加入测序引物退火,制备测序模板。在测序模板中加入测序反应混合液,再依次加入dATPS,α,dCTP,dTTP和dGTP进行测序反应。焦测序反应混合液的组成:0.1mol/LTrisHAc(pH7.7)2mmol/L-3 结果与讨论
3.1 血液抗凝剂对全血直接扩增的影响
为了研究临床常用的血液抗凝剂对全血直接PCR扩增的影响,以MTHFR基因677C>T位点为目的片段进行扩增。使用基于HpHBuffer的缓冲体系对分别含有K2EDTA,枸橼酸钠和肝素钠3种不同抗凝剂的全血样本进行直接扩增,同时以传统PCR扩增体系扩增提取的基因组DNA进行对照。取
3mL扩增产物,用2%琼脂糖凝胶电泳,扩增结果如图1所示。结果表明,以HpHBuffer为缓冲体系对全血样本可直接进行扩增,抗凝剂K2EDTA对全血样本扩增没有影响,
而枸橼酸钠和肝素钠这两种抗凝剂对全血样本的扩增效率有一定程度的抑制,但仍
能满足后续检测的要求。
3.2 全血直接扩增MTHFR基因片段的灵敏度
为了考察全血直接扩增MTHFR基因的的灵敏
度,以K2EDTA抗凝全血为模板,扩增MTHFR基因
中含有677C>T位点的目的片段。在50mLPCR体
系中分别加入0.05~5mL的全血模板进行扩增。取
3mL扩增产物,用2%琼脂糖凝胶电泳,扩增结果如
仍可以观测到微量的扩增产物,但扩增产物的量难
以满足焦磷酸测序对模板量的要求;当全血模板加
入量为0.5mL时,即可获得清晰的扩增条带,且全血
模板的扩增产物能够满足焦磷酸测序的要求。
3.3 PCR扩增产物用量对焦磷酸测序的影响
焦磷酸测序中PCR产物的用量直接影响测序结
果的信号强度。为获得足够的信号强度。以确保检
测结果的可靠性,传统的焦磷酸测序需要25~50mL
PCR产物。大体积的PCR扩增使检测成本增加。为
降低检测成本,需提高焦磷酸测序的灵敏度,本研究
采用本课题组已建立的高灵敏度焦磷酸测序
反应体系[20]进行测序。该体系通过使用高浓
度三磷酸腺苷硫酸化酶捕获游离的APS,极大
降低了APS作为ATP类似物被荧光素酶催化
而产生的背景信号,与传统焦磷酸测序法相
比,检测灵敏度提高了10倍以上。
为了考察不同量的PCR产物对高灵敏焦
磷酸测序信号强度的影响,本研究以MTHFR
图2 全血直接扩增MTHFR基因的灵敏度基因677C>T位点CT杂合子样本为研究对 Fig.2 SensitivityforamplifiyingtheMTHFRgenedirectlyusing象,采用5mL微球制备单链。分别使用10,5图1 全血及基因组DNA对亚甲基四氢叶酸还原酶图2所示。结果表明,全血模板加入量为0.05mL时 (MTHFR)基因677C>T位点的扩增结果Fig.1 Amplificationofmethylenetetrahydrofolatereduc-tase(MTHFR)gene677C>TwithwholebloodandgenomicDNArespectively泳道1.基因组DNA;泳道2.EDTA二钾抗凝全血;泳道3.枸橼酸钠抗凝全血;泳道4.肝素钠抗凝全血;泳道N.空白对照;泳道M.DNAMarker。Lane1.GenomicDNA;lane2.EDTA2K+anticoagulantwhole-blood;lane3.Sodiumcitrateanticoagulantwholeblood;lane4.Sodiumheparinanticoagulantwholeblood;laneN.blankcontrol;laneM.DNAmarkers
和1mLPCR扩增产物进行焦磷酸测序,结果
如图3所示。当PCR产物用量为10mL时,能wholebloodasstartingmaterial.泳道N.空白对照;泳道M.DNAMarker(laneN.blankcontrol;laneM.DNAmarkers)
够得到良好的测序结果;当PCR产物用量为5mL时,信号强度降低了一半,但仍然能够得到准确的序列信息和SNP分型结果;当PCR产物用量为1mL时,信号强度明显降低,仅为10mL时信号强度的20%,但仍然能够得到正确的序列信息和SNP分型结果。通常PCR反应的最小体积为5mL。因此本研究采用5mLPCR产物进行常规的焦磷酸测序反应。
3.4 微球用量对焦磷酸测序的影响
焦磷酸测序中制备单链DNA测序模板需要使用链亲和素包被的磁性或琼脂糖凝胶微球,这类微球成本很高,传统的焦磷酸测序检测需使用5mL微球,检测成本较高。本研究以MTHFR基因677C>T位点CT杂合子样本为研究对象,固定PCR产物用量为5mL,分别使用5,4,3,2和1mL微球(6g/mL)进行焦磷酸测序。测序结果如图4所示,当微球使用量在1~5mL时,测序结果没有明显区别,信号强度比为5mL∶4mL∶3mL∶2mL∶1mL=1均能准确的进行序列判读和SNP分型判断。∶1.25∶1.27∶1.46∶1.15,
结果表明,当使用5mLPCR产物,微球用量大于1mL时,焦磷酸测序结果没有显著区分,但在使用1mL
图3 高灵敏焦磷酸测序对MTHFR基因677C>T位点不同用量PCR产物的检测结果
Fig.3 PyrogramsofMTHFR677C>TwithdifferentamountsofPCRampliconsbyhighlysensitivepyrose-
quencing
图4 高灵敏焦磷酸测序对MTHFR基因677C>T位点不同用量微球的检测结果
微球时,因微球量太少,容易造成操作失误。本研究采用2mL微球进行检测。Fig.4 PyrogramsofMTHFR677C>Twithdifferentamountsofbeadsbyhighlysensitivepyrosequencing
3.5 实际样本测定结果
通过对PCR扩增及焦磷酸测序检测所需PCR产物量和微球用量的优化,建立了最佳检测方案。即采用1mL全血样本对MTHFR基因677C>T和1298A>C两个位点进行全血直接扩增,取5mL扩增产物加2mL微球进行测序。在此优化条件下,对收集的12例临床样本的MTHFR基因677C>T和1298A>C多态性进行检测。12例样本的基因型分别为677C>T位点CC纯合6例,CT杂合5例,TT
““结果表明,本方法对序列具有较高的定量性能,如677CT杂合中“T”C”G”3个信号峰强度的理论比值
““应为0.5∶1.5∶1,实际测得比值为0.511298AC杂合中“C”A”G”3个信号峰强度的理论比值应∶1.56∶1;
为0.5∶2.5∶1,而实际测得比值为0.58适用于临床全血样本的∶2.85∶1。因此本方法具有较高的准确性,
基因多态性检测。纯合1例;1298A>C位点AA纯合6例,AC杂合5例,CC纯合1例。其中典型的测序结果如图5所示。
4 结 论
的活性,从而影响氟尿嘧啶和甲氨喋呤两类常用的化疗药物的疗效和毒副作用[2~4]。同时由于亚甲基四氢叶酸还原酶在体内代谢的重要作用,MTFHR的基因多态性与临床上多种疾病的发生和发展密切相MTHFR基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性会影响其编码产物亚甲基四氢叶酸还原酶
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