爱华网实验四：免疫共沉淀—蛋白质免疫印迹分析
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【实验目的】
1、掌握蛋白质免疫印迹分析的基本原理
2、掌握蛋白质免疫印迹分析的基本操作过程
【实验原理】
蛋白质免疫印迹分析又称Western Blot，是以某种抗体作为探针，使之与附着在固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应，从而对复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴别和定量。这一技术讲蛋白质凝胶电泳分辨率高与固相免疫测定特异性强的特点结合起来，是一种重要的蛋白质分析测试手段。
蛋白质凝胶电泳利用不连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率。由于其电泳体系中有三种物理效应：（1）凝胶的分子筛效应；（2）电泳分离的电荷效应（3）样品的浓缩效应。
固相免疫测定是通过电场作用把凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭非特异位点后，使用目的蛋白的特异抗体检测，并通过种属特异的二级抗体的结合及放射自显影或者原位酶反应，确定抗原-抗体-抗抗体复合物的位置及丰度。
本实验是蛋白质免疫共沉淀实验的第二部分，主要是通过蛋白质免疫印迹分析对大鼠肝组织中PCNA与p21相互作用进行检测。同时，进一步学习蛋白质免疫印迹分析原理及基本操作过程。
【实验流程】
1、配制Tris-SDS-PAGE：a洗板及电泳装置，并确定其底端的密闭性；b配置10%分离胶，灌胶至距梳齿下缘0.5～1cm，加水封闭，聚合约30min；c去水，并配置5%浓缩胶，插入梳子，注意避免气泡，室温约30min；d装好电泳装置，内槽倒满电泳缓冲液，拔去梳子，并冲洗加样孔。
2、准备样品：加入工作液为1×的loading buffer，煮沸5min，瞬离，上样。
3、电泳：80V，30min；100V, 1h。
4、转膜：湿转方式，安放顺序：黑胶（SDS-PAGE）白膜（NC膜），由阳极向阴极依次安放：3层滤纸3张，NC膜，凝胶，3层滤纸；注意除气；电转100V，1h；
5、封闭：5%脱脂奶粉封闭NC膜，室温，1h；
6、一抗孵育：NC膜放入杂交袋，封好三面，加入一抗（1：2000稀释的小鼠抗大鼠PCNA抗体），封严杂交袋，4℃ overnight。
7、漂洗：TBST漂洗三次，每次5min。
8、二抗孵育：NC膜放入杂交袋中，加入二抗（1：2000稀释的HRP-山羊抗小
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鼠IgG），封严杂交袋，于室温1h。
9、漂洗：TBST漂洗三次，每次5min。
10、显影：将ECL化学发光试剂A液B液混合，加在有NC膜面上，反应约1 min，置荧光图像分析系统检测。
【实验结果】
上图所示为Western Blot曝光图，Input即阳性对照，IgG代表阴性对照，Co-IP代表ProteinA拉下的免疫复合物，为待测蛋白，目的条带PCNA蛋白出现在35kD大小处。
【实验讨论】
1、图中在55kD和25kD处的条带为小鼠抗大鼠P21抗体的重链和轻链。
2、由于阳性对照和免疫复合物（Co）均出现目的蛋白，说明最有可能的原因是一抗孵育的操作失误，或者是因为大鼠肝脏的问题。
【Western Blot注意事项】
1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）。
2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。
3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。
4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气
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Input IgG CoIP marker 43KD 34KD
泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。
5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。
6、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。
7、在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清楚目的条带为标准。
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