1.粪便常规 将粪便涂片镜检，若发现革兰阳性杆菌及其芽孢将对临床判断很有帮助。随后可进行分阶段细菌培养，检查有无大量革兰阳性菌。
2.细菌学检查 90%的病例在发病时粪便中可培养到难辨梭状芽孢杆菌。送检时为了减少与空气的接触，必须采取至少多于容器容量的新鲜粪便，连同容器置于加盖密封的广口瓶内，于20min内速送检验。取CCFA专用培养基（由环丝氨酸、噻吩甲氧头孢霉素、果糖和蛋白质琼脂组成） 接种，在厌氧条件下有选择性的分离难辨梭状芽孢杆菌。若菌落呈扁平、边缘不规则、粗糙状，革兰染色为阳性杆菌即可作出诊断。
3.细胞毒素的毒性实验 稀释的大便或细菌培养滤液，对组织培养细胞（HELA）有特异性的细胞病理效应，这种效应可被污泥梭状芽孢杆菌的抗毒素中和，从而证实难辨芽孢杆菌为产毒菌株。
4.毒素A的检测 可以用对流免疫电泳、酶联免疫吸附实验、乳胶凝集实验、单克隆抗体方法等检查毒素A。
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