爱华网[关键词] 痛泻要方； 肠易激综合征； 肝旺脾虚； 内源性代谢物； 代谢组学
[Abstract] To evaluate the effect of Tongxie Yaofang on cardiac endogenous metabolism in irritable bowel syndrome（IBS） rats by using metabolomics method， find its potential biomarkers， analyze the metabolic pathways， and explore the pharmacological effects， mechanisms of action and syndrome essence of syndrome model. Forty Wistar rats were used to establish IBS models， and then randomly divided into four groups： model control group and Tongxie Yaofang treatment groups （high， medium， low dose）. Another 10 rats were used as normal group. The rats in Tongxie Yaofang-treated（low， medium and high dose） groups were orally administrated with Tongxie Yaofang extracts once a day for 2 weeks， respondingly with the doses of 0.203，0.406，0.812 g・mL-1. The rats in normal group and model control group were given with equal volume of saline once a day for 2 weeks. On the 0 and 15th days， serum was collected and each sample extract was analyzed by UPLC-Q-TOF-MS. Eight potential biomarkers were identified and 8 major metabolic pathways were found to be related with IBS diseases neurotransmitter metabolism， inflammatory immunity， brain function and energy metabolism， etc. Tongxie Yaofang had certain pharmacological effects on IBS， and its mechanism may be related to serotonergic synapse， tryptophan metabolism， cysteine and methionine metabolism， glycerophospholipid metabolism， nicotinate and nicotinamide metabolism and so on， which might be the biological basis of IBS liver-spleen deficiency syndrome.
[Key words] Tongxie Yaofang； IBS； liver stagnation and spleen deficiency； endogenous metabolites； metabolomics
本研究�M在前期工作中已进行了较深入的痛泻要方对肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）大鼠模型脑-肠互动效应机制影响的研究[1-2]，并对其作用机制有一定阐释。对机体、病证的作用机制仅通过某些作用靶点、机制、通路来阐释机体证候复杂性、方药成分有效性的研究模式，是不能完全将药物对病证的作用机制阐明清楚。而如何全面、系统的阐明方药对病证整体效应，值得思考。代谢组学通过机体内小分子代谢产物整体变化规律，还原相关联的生物事件，以揭示机体的生物状态实质和药物作用机制[3]。代谢组学具有整体动态、综合与分析等系统方法学特点，有与中医治疗疾病的整体观念相近的特点[4]。方药则可对机体代谢途径中某些环节作用特异性强，干预其代谢产物及代谢网络[5]。通过代谢组学与中医方证相结合，从体内代谢产物的角度明晰方药代谢网络干预效应，而明确对动物模型的作用机制及实质。因此，本实验将IBS病证结合模型和代表方药――痛泻要方作为有机系统进行研究，通过痛泻要方对IBS动物模型血清内源性代谢物干预效应的评价，研究其对IBS病证模型调控差异、调控效应，发掘出其生物标记物，建立其代谢模式特征，通过基于体内作用的物质质量变化规律以探求痛泻要方的作用本质及所适应病证模型的证候本质。 1 材料
高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱系统（UPLC-Q-TOF-MS系统），包括Waters AcquityTM Ultra型高效液相色谱仪，Triple TOF 5600+型飞行时间质谱仪，MassLynxV4.1工作站（Waters公司，美国）；电喷雾离子源（AB SCIEX公司，美国）；KDC-40型低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司，中国）；D-78532型Tuttligen离心机（Hettich公司，德国）；Vortex3000型旋涡混合机（wiggens公司，德国）；Academic纯水制备系统（Milli-Q公司，美国）；Forma 995型超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；B3200S-T型超声震荡仪（必能信超声上海有限公司，中国）；KDC-160HR型高速台式冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司，中国）；SK-1型快速混匀器（江苏医疗仪器厂，中国）；cp2465型血管成形术球囊（EV3公司，美国）；E206Fr型儿童导尿管（3 mL，沈阳市博斯林医疗器械有限公司，中国）；DYM型硬膜外麻醉导管（1.0×1，扬州华夏医疗器械有限公司，中国）。
痛泻要方源自《丹溪心法》，炒白术（Atractylodis Macrocephalae Rhizoma），炒白芍（Paeoniae Radix Alba），炒陈皮（Citri Reticulatae Pericarpium），炒防风（Saposhnikoviae Radix），上述样品由黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定。精准称量白术81 g，白芍54 g，陈皮40.5 g，防风27 g（6∶4∶3∶2），生药用10倍蒸馏水浸泡0.5 h，加蒸馏水煎煮2次。第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1.0 h，然后将2次滤液合并，过滤杂质，水浴加热浓缩滤液，提取液减压浓缩得到100 mL浓缩液，药物提取物收率为2.03 g・mL-1。制成冻干粉末后以HPLC测定主要成分白术内酯Ⅰ，白术内酯Ⅱ，白术内酯Ⅲ，芍药苷，质量分数分别为0.043 8，0.031 4，0.154 5，0.234 1 mg・g-1。4 ℃保存待用。临用时以蒸馏水配制成生药浓度为0.203（临床等效量），0.406，0.812 g・mL-1的药液。
乙腈（色谱级，Thermo Fisher Scientific公司，美国，A998-4）；甲醇（色谱级，Dikma Technologies公司，美国，CAS-67-56-1）；甲酸（色谱级，Tedia公司，美国，FS0630-015）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料公司，中国，GB19298）。
2 方法
2.1 IBS模型复制、分组及给药
Wistar大鼠，清洁级，雌雄兼用，出生8 d，体重（11±2）g，购于黑龙江中医药大学（黑动字第P00102006）。大鼠自由进食饮水，室温21～24 ℃，湿度50%～60%。采用乳鼠直肠扩张刺激法[6]结合母婴分离法[7]，母鼠与其乳鼠共同饲养在笼内，乳鼠第8～12天以血管成形术球囊（囊长15 mm）插入直肠，至球囊末端距离肛门2 cm，缓慢逐渐地向球囊注水以扩张肠道，2次/日，每次持续1 min，2次间隔30 min。第13～17天，以囊长20 mm的血管成形术球囊扩张直肠，其余条件不变。第18～21天改为儿童导尿管扩张直肠，注入水0.1 mL，其余条件不变。每天乳鼠直肠扩张后，单独放入其他笼内，与母鼠分离1 h，之后再与母鼠同放笼内。造模2周。通过腹部撤离反射实验（AWR）评价模型，评价成功者为成模的IBS模型。将成模的IBS大鼠按体重随机分为4组，分别为模型对照组（M）、痛泻要方[高（G）、中（Z）、低（D）]3组，各组10只，另设正常对照组（K）10只。痛泻要方G，Z，D 3组每天分别灌胃给予8.12，4.06，2.03 g・kg-1痛泻要方药液。正常对照组、模型对照组按等体积灌服生理盐水。每组给药2周。
2.2 生物样本采集及处理方法
实验造模第0，15天眼底采血2 mL，4 ℃下3 000 r・min-1离心10 min，取上层血清。作为不同时间点血样。置于-80 ℃冰箱保存备用。样品常温解冻，取血清100 μL，加入400 μL甲醇以稀�，涡旋2 min以混匀充分，在4 ℃条件下3 000 r・min-1离心15 min，以沉淀蛋白，吸取200 μL上层血清再加入10 μL内标（1 g・mL-1氯苯丙氨酸水溶液），以3 000 r・min-1涡旋2 min，吸取上清液放置于玻璃进样小瓶以备用。
2.3 代谢组学数据采集
进样分析。色谱条件：Rapid Resolution色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.4 mL・min-1；柱温30 ℃；扫描范围190～400 nm；检测波长210，254，280 nm；进样量2 μL；流动相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱，0～3 min，98%～48%A，3～10 min，48%～2%A，10～12 min，2%～98%A，12～14 min，98%A。质谱条件：正/负离子一级质谱（MS）条件为ESI（电喷雾离子源），LockSprayTM校正系统进行在线质量校正，扫描检测m/z 50/1 500，扫描时间0.2 s，毛细管电压3.00 kV，样品锥孔电压35 V，提取电压4.0 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂温度350 ℃，锥孔气流量50 L・h-1，脱溶剂氮气流量650 L・h-1，碰撞能6～30 V。 2.4 数据处理和统计学方法
2.4.1 统计学分析 数据以±s表示，数据处理应用SPSS 17.0统计软件。在评估原始数据符合正态分布方差基础上，组间差异比较采用单因素ANOVA方差分析，组间差异采用t检验，P 2.4.2 生物标记物分析 测定的尿液代谢轮廓质谱数据应用Markerlynx软件进行数据降维和质谱矩阵信息获取。通过ssLynxV4.1工作站软件中非监督主成分分析（principal component analysis，PCA）、最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）对各组样本的代谢组图谱进行模式识别分析，对各个组别的观测值进行区分。同时对所获得计量数据进行统计分析，依据变量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）、VIP置信区间评价、筛选潜在生物标记物。取VIP>1.5的离子进行组间比较，组间差异采用t检验，P 3 结果
3.1 血清代谢轮廓整体表征
基于优化的液质分析条件对各组大鼠0，15 d血清样本进行分析，分别于正负离子扫描模式下对血清样本进行设定质量范围的扫描分析，得出质谱轮廓图谱BPI，BPI图上不同组别血清样本的区分度较好，代谢物谱明显不同，有较好的分离和响应效果，见图1～4。
3.2 血清代谢数据PCA分析
进一步研究发现，各组大鼠正、负离子条件下血清样本在PCA得分图二维空间上均表现出完全分离状态，表明经直肠扩张结合母婴分离刺激诱导，大鼠生理机能发生变化，进而反映在大鼠血清代谢轮廓的改变，反应了IBS肝旺脾虚证及痛泻要方对模型干预的代谢表征。通过对各组样本的代谢轮廓进行OPLS-DA分析，得到用于评价代谢轮廓分组贡献率的scores plot图，对各组血清样本代谢组图谱进行模式识别分析。由各图可见，各组的数据点无重叠/重叠少，表明组间存在差异。依据VIP和VIP置信�^间评价、筛选潜在生物标记物。
3.2.1 IBS疾病模型的血清代谢组学研究 PCA，OPLS-DA得分图见图5，6，IBS模型大鼠的血清与正常对照组血清相比，数据点无重叠，明显分类于不同象限，在得分图中显现明显的分离状态，2组血清代谢区分很好，说明大鼠经过造模后，正常对照组与IBS模型组大鼠的代谢产物存在明显差异，血清中代谢物组发生显著变化。给药前与给药后15 d，2组得分图的分离均比较明显，说明IBS模型大鼠在15 d内比较稳定。
3.2.2 痛泻要方对适配IBS疾病模型干预的血清代谢组学研究 PCA，OPLS-DA得分图见图7，8。
0 d IBS大鼠与各痛泻要方组的血清数据点重叠，明显分类于相同象限，在得分图中也显现未分离状态，说明大鼠经过直肠扩张结合母婴分离刺激诱导，模型组与各痛泻要方药组代谢产物相同，表明分组无差异，均为IBS大鼠，造模成功。IBS模型大鼠和各给药组与正常对照组的血清相比，数据点无重叠，明显分类于不同象限，在得分图中显现明显的分离状态，代谢区分很好，说明大鼠经过造模后，IBS大鼠的代谢产物与正常大鼠相比，存在明显差异，血清中代谢物组发生明显的变化。
PCA，OPLS-DA得分图见图8，15 d IBS模型大鼠与各给药组的血清数据点已离散，明显分类于不同象限，在得分图中也显现分离状态，各组血清代谢区分很好，说明IBS模型大鼠经过痛泻要方干预后，与模型对照组相比，代谢产物组已发生明显的变化。痛泻要方各剂量组在得分图中显现分离状态，但区分程度一般，中、高剂量组数据点分布与正常对照组接近。
3.3 潜在生物标记物的鉴定
根据所得分子离子碎片的鉴定结果，通过HMDB数据库、METLIN鉴定到尿液中可能的生物标记物有8种是与痛泻要方治疗IBS相关的具有显著差异的代谢产物，并呈现一定程度的上调或下降趋势，这些生物标志物分别归属于氨基酸、有机酸、糖类、糖苷类、胆碱类，见表1，2。其中有D-ribulose，malonic acid，valyl-serine，betaine，nicotinamide-riboside，5-hydroxy-L-tryptophan （5-HTP）5个生物标志物在KEGG查到代谢通路，主要涉及血清素突触、色氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、磷酸肌醇代谢、甘油磷脂代谢、烟酸和烟酰胺代谢、维生素B6及蛋白质、氨基酸、糖类代谢等相关通路。
4 讨论
代谢组学是一门系统研究代谢产物变化及其规律的科学，以揭示机体生命活动代谢本质。内源性代谢物变化能直接反映体内生化过程和状态变化，药物对主要生物标记物所涉及代谢通路的某些过程具有特异性作用，使其内源性代谢物发生明显变化[8]。代谢组学通过检测获得体液的代谢指纹图谱和分析引起代谢谱变化的原因，研究药物引起的内源性代谢物的变化，探察复方中药在代谢调控中所起的作用和如何起作用，探明其确切的作用机制，并可能明确复方与病证的相关性。
痛泻要方始载于《丹溪心法・泄泻卷》，用于脾虚肝旺之痛泻。本课题组在前期研究工作采用3种IBS复制方法进行痛泻要方方证相关研究。其中一种为将乳鼠直肠扩张刺激法结合母婴分离模型二法结合复制IBS，乳鼠直肠扩张刺激法为目前IBS造模应用最广的方法、最合理的动物模型，属于局部机械刺激；母婴分离属于早期生活事件，能模拟情绪焦虑，并有应激反应增强和内脏高敏感性反应[9]。结果表明，痛泻要方对3种IBS模型的症状及脑肠肽表达指标均具不同程度的改善作用，与其他2种模型相比，以乳鼠直肠扩张刺激法结合母婴分离组最优，不仅具有扶脾之功，又有抑肝之效，具有明显效应及关联性，此模型证为肝旺脾虚，与痛泻要方方证相关[10]。因此，在此部分研究中，采用此模型作为IBS模型进行痛泻要方的代谢组学研究。 本研究采用液质联用结合MassLynx软件的统计分析方法对IBS大鼠血清进行代谢组学研究。从正常对照组、IBS模型组及痛泻要方干预组的代谢表征来看，IBS大鼠血清中3-nitrotyrosine，D-ribulose，glutamyl-histidine，valyl-serine，bataine，nicotinamide-riboside表征降低，而malonic acid，5-HTP表征提高。痛泻要方可使3-nitrotyrosine，D-ribulose，glutamyl-histidine，valyl-serine，bataine，nicotinamide-riboside含量提高，而malonic acid，5-HTP含量降低。由此推测痛泻要方调节机制可能涉及以下几个方面。
4.1 血清素突触和色氨酸代谢
5-HTP涉及血清素突触通路及色氨酸代谢。5-HTP由色氨酸经色氨酸羟化酶转化，再经脱羧反应合成5-羟色氨（5-hydroxytryptamine，5-HT），又称血清素。5-HT作为信号传导分子在肠、脑间传递信息，是脑-肠轴的重要神经递质[11]，既具有调节肠道运动、分泌和感知等功能，还可调节情绪、睡眠等。5-HT含量变化与IBS诸多复杂病证的发生发展有着密切关联，在其发病机制中占有主导地位。肠道中的5-HT参与肠道感觉、分泌及运动调控，中枢神经系统的5-HT可导致精神、行为障碍，调节情绪、睡眠等，参与脑-肠互动的生物化学信号异常过程[12]。IBS模型大鼠血清的5-HTP代谢升高，表明IBS模型存在5-HT分泌、释放及代谢异常等的病理机制，与前期研究相符[13-14]。痛泻要方可降低血清中5-HTP含量，结果说明痛泻要方可能通过调节IBS模型大鼠5-HT代谢及神经突触而参与IBS内脏高敏性、胃肠运动等调控而缓解症状，提示痛泻要方改善肝旺脾虚证IBS与调节血清素突触通路及色氨酸代谢有关。
4.2 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢
Betaine，D-ribulose参与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，降低人体内半胱氨酸潜在的毒性水平[15]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的中间产物。Hcy具有极高的生物活性，参与多种炎症及免疫紊乱性疾病。肠道黏膜低度炎症和免疫激活在IBS发病机制中占重要作用，而Hcy与IBS炎症免疫的发生发展有着密切关系[16]。Hcy的促炎作用还可影响�c道黏膜屏障而加重IBS病理生理状态[17-18]。另外，Hcy的含量与抑郁症的发病率呈正相关[19]。IBS患者常伴有抑郁、焦虑、情绪低落等心理障碍。IBS的生物-心理-社会模式病理生理的假定，强调了心理困扰在IBS的发病机制中的重要性[20]，涉及脑-肠轴功能异常。因此，可以分析出Hcy不仅与IBS炎症免疫反应有着密切关系，对IBS抑郁等心理应激亦有密切关联。
结果表明，IBS模型大鼠血清中betaine，D-ribulose含量显著降低，提示IBS大鼠的Hcy甲基化途径抑制，存在Hcy转硫代谢途径异常。提示痛泻要方可能通过升高betaine，D-ribulose代谢表征，调节半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，降低Hcy产生，而改善IBS的肠道炎症反应及心理情志变化。痛泻要方改善IBS大鼠情志抑郁，急燥易怒，腹痛腹胀肠鸣等肝旺证与调控半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径相关，体现了抑肝之功。
4.3 维生素B6代谢
D-ribulose涉及维生素B6代谢。维生素B6作为辅酶，参与氨基酸、蛋白质等多种代谢反应。缺乏维生素B6，可导致蛋白质水解及转化为脂肪的过程停滞，生长停止。而实验结果显示给药后D-ribulose上调，表明维生素B6合成增加，促进蛋白质代谢。
4.4 烟酸和烟酰胺的代谢
烟酰胺核糖核苷脱核糖核苷生成烟酸，烟酸在体内转化为烟酰胺。肠黏膜机械屏障是肠黏膜屏障的结构基础，防止细菌的侵袭及炎症，肠道慢性炎症及低度炎证常伴随肠道黏膜屏障受损。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP-1）具有修复机体DNA和维持基因组稳定作用，PARP-1过度激活，快速消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），导致ATP消耗，导致细胞坏死和功能失调。烟酰胺能促进机体氧化还原反应，通过抑制PARP-1控制NF-κB调控的多种代谢转录通道[21]，具有明显扩张血管作用，可以明显减轻肠道损伤。烟酸被用于合成NAD与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP），沉默信息调节因子1（sirtuin 1，SIRT1）是一种依赖于NAD+的去乙酰化酶。在慢性炎症过程中，SIRT1具有减少炎性因子释放、抑制炎性因子所致细胞毒性反应的作用，从而保护肠黏膜[22]。
研究表明，IBS模型大鼠血清中烟酰胺核糖核苷含量显著降低，表明IBS大鼠的烟酸和烟酰胺代谢途径抑制，烟酰胺核糖核苷参与了IBS病理生理过程。提示痛泻要方可能通过烟酰胺核糖核苷调节烟酸和烟酰胺代谢，改善IBS的炎症反应，减轻肠道损伤。
4.5 甘油磷脂代谢
Valyl-serine参与甘油磷脂代谢，甘油磷脂在细胞识别和信号传导过程中发挥重要作用。磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）是含有valyl-serine的甘油磷脂[23]，作为脑神经活化的主要成分，主要存在大脑中，具有调控大脑神经功能作用，可改善大脑功能，修复大脑损伤，可促进Ach的释放，增强Na+/K+-ATP酶的活性，提高认知能力[24]，增强大脑机能[25]；PS能降低应激激素水平，提高抑郁患者去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）和5-HT含量，减轻紧张压力、缓解抑郁症状[26-27]，对神经系统具有重要作用。 研究表明，IBS模型大鼠血清中valyl-serine含量显著降低。提示IBS大鼠的甘油磷脂尤其PS代谢异常，表明在IBS病理生理过程甘油磷脂在细胞识别和信号转导的作用受到影响，IBS大鼠出�F情绪低落、烦躁倦卧等症状，经痛泻要方干预后，IBS大鼠血清中valyl-serine表征增加，说明痛泻要方参与甘油磷脂代谢，PS合成增加，改善神经功能，缓解IBS的各种症状反应。提示痛泻要方改善IBS大鼠情志抑郁，急燥易怒，腹痛腹胀肠鸣等肝旺证与调控甘油磷脂代谢途径相关，体现了抑肝之功。
4.6 磷酸肌醇代谢
Malonic acid参与磷酸肌醇（inositol phosphate，IP）代谢。IP是一类磷脂的总称，其中三磷酸肌醇（IP3）为三磷酸磷脂肌醇的酶代谢物，具有诱发Ca2+释放的重要功能，可瞬间提高胞液中Ca2+浓度。Ca2+为重要的胞内信使物质，磷酸肌醇代谢对细胞信号传递过程发挥重要调节效应。Ca2+过度积聚可导致神经元变性、损伤。实验研究表明，IBS模型血清中malonic acid含量升高，参与磷酸肌醇代谢，有可能导致神经元中Ca2+离子浓度明显提升，导致信号转导亢奋，痛泻要方可能通过降低malonic acid含量，参与磷酸肌醇代谢，致神经元中Ca2+释放减少，阻止其积聚，抑制信号转导活性，改善神经可塑性而发挥效应[28]。
4.7 糖、蛋白质、能量代谢
D-ribulose还参与蛋白质、氨基酸及糖类的生物合成代谢。丝氨酸参与脂肪和脂肪酸的新陈代谢，促进肌肉生长，维持免疫系统的健全。Betaine参与ABC转运。能量代谢是机体内代谢过程中所产生的能量释放、转移和利用，与“脾主运化”理论有着密切联系。提示IBS大鼠具有机体能量代谢障碍、免疫机能紊乱及生长抑制表现，为中医脾虚证表征。痛泻要方干预后可提升D-ribulose代谢表征使其代谢网络改善，表明痛泻要方可从糖、氨基酸代谢等方面提高IBS脾虚证的能量代谢低下状态。提示痛泻要方改善IBS大鼠体倦乏力、神疲纳呆等脾虚证与提高机体能量代谢相关并调控免疫机能，体现了扶脾之功。
5 结论
综上所述，IBS模型复制及在痛泻要方干预后，内源性代谢物发生明显变化，其中已可明确代谢通路涉及血清素突触和色氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、维生素B6代谢、烟酸和烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢、磷酸肌醇代谢及蛋白质、氨基酸及糖类的生物合成代谢等几个方面。由于调节的复杂性，目前还不完全清楚内源性代谢物异常表达的生物学意义，然从结果分析可以看出，代谢物表征的异常可能是IBS肝旺脾虚证的生物学基础，而痛泻要方则对与肝旺脾虚证相关的内源代谢物发挥复杂的调节作用，体现了扶脾抑肝之功。
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[责任编辑 曹阳阳]
