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作者简介：赵小英（1973-），女，湖南慈利人，湖南大学副教授
摘要：AtWNK9为拟南芥WNK（With no lysine kinase）激酶家族成员，其功能尚不清楚采用生物信息学和生物学实验相结合的方法，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞定位、启动子元件、基因表达模式进行了分析研究发现，AtWNK9定位在细胞核中；该基因在拟南芥根中高效表达，其表达受ABA，NaCl、葡萄糖、热和冷等非生物胁迫处理强烈诱导结果表明，AtWNK9为非生物胁迫反应相关基因，并可能参与根的生长发育
关键词：基因表达；拟南芥；AtWNK9
中图分类号：Q94 文献标识码：A
WNK激酶（With no lysine kinase）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶家族成员之一，因其家族成员在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二个亚结构域缺乏一个赖氨酸残基，动物WNK激酶中赖氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中常被天冬酰氨（ N）或丝氨酸（ S ）替代，但激酶的生物活性没有发生变化，因此表明WNK激酶是一种特殊的蛋白激酶
Nakamichi等在双子叶植物拟南芥中克隆到植物中第一个WNK基因AtWNK1，随后又成功分离到了AtWNK2-98个WNK基因，并发现AtWNK2，AtWNK4，AtWNK6涉及拟南芥昼夜节律的调控过程AtWNK2，AtWNK5，AtWNK8的TDNA插入突变导致拟南芥早开花，AtWNK1的TDNA插入突变表现出了晚花的表型最新研究发现，破坏AtWNK8能提高拟南芥对盐和渗透压力的抗性 目前，在单子叶植物水稻中发现7个WNK基因，其中OsWNK1被发现参与各种非生物胁迫如冷、热、盐、干旱胁迫等Wang等在大豆中鉴定了一个根特异性的WNK同源基因，GmWNK1，它通过与ABA分解代谢相关的蛋白GmCYP707A1相互作用微调ABA的水平，从而调控大豆晚期侧根的发育随后又发现GmWNK1能增强植物对NaCl和渗透压的抗性目前，有关拟南芥AtWNK9基因的功能尚处于未知状态，因此系统研究AtWNK9基因的功能对全面了解拟南芥WNK激酶的功能具有十分重要的意义
生物信息学作为研究过程中的一项技术和开发工具在核酸及蛋白质序列分析及功能预测中发挥重要的作用基因蛋白结构与表达的生物信息学分析结果对后续基因功能研究有重要的指导意义本研究采用生物信息学和生物学实验相结合的手段，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞以及基因表达情况进行了分析，这将为进一步研究该基因的功能奠定基础
1 材料与方法
11植物材料和载体
拟南芥野生型Col4为哥伦比亚生态型，大肠杆菌DH5α菌株和pA7YFP载体均为本实验室保存
12生物信息学分析
运用简单模块构架搜索工具SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）（http：//smartemblheidelbergde/smart/）和NCBI网站提供的保守结构域检索工具CDART（Conserved Domain Architecture Retrieval Tool）（http：//wwwncbinlmnihgov/Structure/）对AtWNK9蛋白进行保守结构域分析；利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的NetPhos20 Server程序（http：//wwwcbsdtudk/services/NetPhos/）分析磷酸化位点；利用WoLF PSORT工具（http：//wolfsortseqcbrcjp）和TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库SUBA （The SubCellular Proteomic Database）（ http：//suba2plantenergyuwaeduau/）预测蛋白质亚细胞定位[13-14]；通过TAIR网站中提供的Arabidopsis eFP Browser链接（http：//bbcbotanyutorontoca/efp/）分析AtWNK9基因的表达谱[15]利用植物Plant CARE在线分析工具（http：//bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare/）对AtWNK9基因上游1 000 bp的启动子顺式作用元件进行分析[16]
13 35S：：AtWNK9YFP 融合表达载体构建
以拟南芥野生型Col4为材料，采用RTPCR方法，首先提取总RNA并逆转录为cDNA，然后以此cDNA为模板，利用引物AtWNK9YFPF（ACGCGTCGACATGATGAACAATCTC AGCCATCTT），AtWNK9YFPR（GGACTAGTGT CTTCTTCGTCAGAG TCGTTT）（下划线碱基部分分别为SalⅠ和SpeⅠ酶切序列），通过PCR扩增得到AtWNK9目的基因的全长cDNA序列采用酶切连接的克隆方法，将该片段连接到pA7YFP载体中，构建绿色荧光蛋白与AtWNK9基因融合表达的载体35S：：AtWNK9YFP
14PEG介导的原生质体转化
为确定AtWNK9基因在细胞中表达的具体部位，将上述构建的35S：：AtWNK9YFP进行原生质体转化参照文献[17]的方法，将未抽台前的叶片约90片，切成1 mm宽的长条（长度不定），置于500 mmol甘露醇溶液中将细条捞出，置于含有纤维素酶和果胶酶的酶解液中，黑暗23 ℃，40～50 r/min解析3 h以制备原生质体取约10～20 μg 35S：：AtWNK9YFP质粒于15 mL离心管中，随后依次加入100 μL的原生质体和110 μL PEG/Ca溶液，轻柔混匀放置20～30 min后，去除PEG，用W5溶液（154 mM NaCl，125 mM CaCl2， 5 mM KCl，2 mM MES）终止反应，然后置于云孔板内23 ℃ 黑暗下培养6～18 h后，在荧光倒置显微镜下观察和分析AtWNK9的亚细胞定位 15胁迫处理
拟南芥野生型Col4种子经深层（1% 次氯酸钠10 min，无菌水洗5次）消毒后，4 ℃ 春化3～4 d，然后播种在MS培养基上放置在22～23 ℃培养箱连续白光培养12 d后，用ABA（100 μM）[18]NaCl（300 mM）[19]、葡萄糖（2%）[20]、热（37 ℃）[21]、冷（4 ℃）[22]进行处理，清水处理作为对照，在不同的时间点收取材料，液氮速冻后，于-80 ℃保存，用于后续的实时定量PCR分析
16实时定量PCR分析
采用TRIGene（GenStar）提取总RNA，按照Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas）试剂盒提供的方法，反转录合成cDNA在定量PCR仪（Mx3 000 P）上，按照SYBR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time）（TakaRa）定量试剂盒的说明进行定量PCRPCR反应条件为： 94 ℃预变性10 min，94 ℃变性 30 s，57 ℃退火30 s， 72 ℃延伸 30 s， 40个循环每个实验至少重复3次，持家基因ACTIN2 作为分子内标本研究采用的定量PCR引物见表1
2 结果
21AtWNK9蛋白结构分析
运用简单模块构架搜索工具SMART和NCBI中的CDART软件对AtWNK9蛋白进行保守结构域分析，发现AtWNK9在第25到第282个氨基酸区域，包含了一个保守的丝氨酸苏氨酸激酶催化结构域（STYKc）和一个蛋白激酶催化结构域（PKc）（图1（a）），因此，AtWNK9被归类为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的NetPhos20 Server程序对AtWNK9蛋白进行磷酸化位点分析从图中可看出，AtWNK9蛋白氨基酸序列中的17个丝氨酸（S），2个苏氨酸（Thr）和7个酪氨酸（Tyr）蛋白激酶磷酸化位点（图1（b））这说明AtWNK9具有自身磷酸化的特点
22AtWNK9基因亚细胞定位分析
采用WoLF PSORT工具对AtWNK9的亚细胞定位进行预测，得知AtWNK9定位在胞质中；采用TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库SUBA进行预测，得知该基因定位在细胞核中为进一步确定AtWNK9的亚细胞定位，我们采用PEG介导的原生质体转化方法[17]进行了分析研究
首先，采用PCR扩增，得到AtWNK9的全长cDNA序列，大小为1 400 bp左右（图2（a））用限制性内切酶SaIⅠ和SpeⅠ将该片段和pA7YFP载体进行双酶切，分别得到大小为4 900左右和1 400 bp左右的酶切片段（图2（b））回收酶切片段，用T4DNA连接酶进行连接反应将反应液转化大肠杆菌DH5 α，然后对阳性克隆进行PCR和双酶切（HindⅢ和BamHⅠ）鉴定，PCR产物及酶切片段大小与预期片段大小相一致（图2（c），（d）），表明成功构建了35S：： AtWNK9YFP重组质粒随后，以载体35S：：YFP质粒作为对照，将重组质粒35S：：AtWNK9YFP转化拟南芥原生质体，在荧光倒置显微镜下观察融合基因的表达情况（图3）绿色荧光蛋白基因YFP在细胞的所有部位都高效表达（图3（b）），融合基因AtWNK9YFP则仅在细胞核中表达较强（图3（d）），与蛋白亚细胞定位数据库SUBA预测结果相一致，表明AtWNK9编码核蛋白
23AtWNK9组织器官表达模式分析
基因的时空表达模式可为预测和研究其生物学
功能提供参考依据根据TAIR网站中eFP Browser连接提供的数据，对AtWNK9基因在拟南芥不同组织器官中的表达谱进行了分析整理（图4（a））AtWNK9基因在拟南芥植株的根、下胚轴、叶、花等各个组织器官中均有不同水平的表达，在根中的表达量最高此外，AtWNK9在不同部位的叶片、茎、花和花粉中的表达也存在一定的差异但表达水平都比较低（图4（a））为了进一步确定AtWNK9 基因在不同组织器官的表达模式，采用实时荧光定量PCR检测了该基因在拟南芥根、莲座叶、茎生叶、茎、花和果荚中的表达情况从图4（b）中可看出，AtWNK9在所有被检测的组织器官中均有表达，其中在根中的表达量最高，约为其它器官中的3～5倍，其次为茎这与eFP Browser连接提供的数据基本一致，推测AtWNK9可能参与根的生长发育
24 AtWNK9基因表达对非生物胁迫的响应
利用植物启动子顺式作用元件分析网站Plant CARE在线分析了AtWNK9基因上游1 000 bp的调控区域结果发现，AtWNK9基因的调控区域存在大量激素响应与胁迫响应相关的元件，包括赤霉素反应元件（GibberellinResponsive Element， GARE）、热胁迫响应元件（HSE）、逆境和胁迫响应元件（TCrichrepeats）等顺式作用元件
为了研究AtWNK9基因的表达是否响应激素、逆境胁迫，实验中对12龄拟南芥幼苗分别进行ABA、盐、葡萄糖、热、冷胁迫处理，采用实时定量PCR分析了AtWNK9基因的表达情况结果如图5所示，AtWNK9基因的表达受胁迫处理强烈诱导，其中ABA的诱导效应最明显，AtWNK9的转录水平在ABA处理4 h即达到峰值，为对照处理的8～9倍，在随后的8 h内其表达量仍然维持较高的水平；AtWNK9基因对NaCl处理的响应更快，在处理2 h达到最大值，为对照处理的8～9倍左右，随处理时间延长AtWNK9基因的表达量迅速下降，但仍为对照处理的2～3倍；AtWNK9对葡萄糖、热、冷胁迫的响应相对较弱，分别在葡萄糖处理4 h，热、冷处理6 h达到最大值，为对照处理的5倍、3倍和6倍；AtWNK9对水处理（对照实验）几乎没有响应，说明AtWNK9基因为植物胁迫反应相关基因 3讨论
对基因的生物信息学分析，可为预测其生物学功能提供参考本研究首先利用生物信息学的手段对AtWNK9的核苷酸及蛋白质序列进行了保守结构域和磷酸化位点分析，发现AtWNK9基因包含与蛋白激酶催化结构域（PKc_）和丝氨酸苏氨酸催化结构域（STYKc）具有高度相似性的结构域，且存在多个磷酸化位点，与WNK激酶家族中其他成员的结构特征一致[23]，因此，AtWNK9具有自身磷酸化特点，这还需作进一步研究
基因的表达部位及表达模式通常与基因的功能有紧密的联系结合生物信息学分析、原生质体转化及荧光定位分析，得知AtWNK9在细胞核中表达，说明AtWNK9基因编码核蛋白此外，根据eFP Browser提供的数据及实时定量PCR分析，证明了AtWNK9基因在拟南芥根中高效表达，这与Wang等的RT～PCR实验结果相吻合，说明AtWNK9可能参与根的生长发育
利用Plant CARE对AtWNK9启动子顺式作用元件进行分析，结果显示：启动子区域存在大量激素响应与胁迫响应相关元件通过激素和胁迫处理发现，AtWNK9基因的表达受ABA，NaCl等非生物胁迫强烈诱导，说明AtWNK9为非生物胁迫反应相关基因这为进一步研究AtWNK9基因的生物学功能奠定了良好基础
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