cDNA文库 cDNA文库-mRNA，cDNA文库-TRNA

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cdna_cDNA文库 -mRNA

制备

动物细胞mRNA的制备

植物细胞mRNA的制备

来源

选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量

完整性

1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统"。

无细胞提取物的制备：

用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.

常见的体外无细胞翻译系统:

兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.

缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。

麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.

利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。

优 点：适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.

缺 点：不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.

哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译

*SDS-PAGEanalysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells

2、mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力

3、mRNA分子的大小

哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.

4、总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力

利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA

*Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;

Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII

丰度

1)高丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .

2) 低丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.

5,mRNA的富集方法

典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.

mRNA的丰度与文库克隆子数的关系

ln(1-P)

N= ln(1-1/n)

N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例

1) 按大小对mRNA进行分级分离

* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.

* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.

2) cDNA的分级分离

* mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.

* 优 点:

a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解

b)增加了获得全长cDNA克隆的概率

c)获得更准确的分级分离效果(分子量)

3)多聚核糖体免疫学纯化法

* 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.

分离

1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法

准备工作：

1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。

2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。

3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。

试验步骤：

表3：加入试剂量据此表

1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul

2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀

3. 置于70℃水浴中3min

4. 取出置于室温（20℃－30℃）10min

5. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。

6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min

7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，离心1min

9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。

10. 测OD,并电泳定量。

2.磁珠法分离mRN

1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.

2. 65ºC加热10分钟。

3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。

4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.

5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。

6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7. 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA―PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。

8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。

9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.

10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。

11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。

13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。

14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC沉淀过夜。

15.4ºC，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。

16.4ºC，7500g离心10 分钟。

17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。

18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱

注意事项：

1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行

2．如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。

3．mRNA的电泳图是smear。

cdna_cDNA文库 -TRNA

TRNA提取

试剂配制

准备工作：

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：

▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5

三水合柠檬酸纳 22.94g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠：

肌氨酸钠10g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲变性裂解液：

0.78M柠檬酸钠 8.25ml

10%肌氨酸钠12.375ml

异硫氰酸胍118.05g

加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用

临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）

▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5

NaAc・3H2O 13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲3M醋酸钠 PH=5

NaAc・3H2O 20.4g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲ 4M LiCL:

LiCL 24.164g

加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用

▲0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用

▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC・3H2O 4.10g

0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。

▲ 1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加DEPC水270ml，用时现配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油（高压过） 200UL

溴酚兰 10ul

甲醛(37%) 72ul

去离子甲酰氨310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃ 可保持3个月

▲ 10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至 1000ml

▲变性电泳胶：

称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液：

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml

2.动物组织t RNA的提取

1． 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。

2． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。

3． 根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。

4． 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

5． 冰浴10分钟。

6． 4°C，12000g离心20分钟。

7． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8． 加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。

9． 4°C，12000g离心20分钟。

10． 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11． 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

12． 4°C，12000g离心20分钟。

13． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。

14． 4°C，12000g离心20分钟。

15． 弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。

16． 弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

17． 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。

表 1

3.植物组织t RNA的提取

1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。

3. 加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。

4. 加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。

5. 冰浴10min。4℃，12000g离心10min

6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。

7. 4℃，12000g离心20min。

8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。

9. 4℃，13000rpm离心15min。

10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。

11. 4℃，13000rpm离心10min。

12. 取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。

13. 4℃，13000rpm离心15min。

14. 弃上清，用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。

15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。

16. 用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1． 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2． 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。

3．室温温育10分钟 。

4． 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。

5． 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。

6． 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。

7． 4ºC,12000g离心10分钟。

8． 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9． 4ºC，7500g离心5分钟。

10． 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11． 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。

表2

cdna_cDNA文库 -cDNA

cDNA双链合成

1. Superscipt II―RT合成第一链:

1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入

xul mRNA(大约500ng)

1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x ul RNase-free water

（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）

2. 混匀后,70℃反应10分钟;

3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;

4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:

4ul 5×first strand buffer

2ul 0.1M DTT

1ul 10mM dNTP(自己配制)

5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II―RT,混匀;

7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.

2. cDNA第二链的合成

1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP(自己配制)

xul dd H2O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

总体系为200ul;

2. 混匀后,16℃反应2.5小时;

3. 70℃灭活10分钟;

4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;

5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。

注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。

3. 双链cDNA末端补平

1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)

2ul BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;

4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;

5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;

8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.

注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程：

1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。

2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

3．加入spin column中，13000rpm离心1min。

4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。

5．13000rpm，再离心1min。

6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。

7．13000rpm离心2min。

8．加入30ul buffer EB，静置10min。

9．13000rpm离心2min。

10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

4 EcoR I adaptor 加接

1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;

2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:

1.2ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)

3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;

5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;

2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2O

1ul T4 PNK(10U/ul)

3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;

4. 稍微离心使反应物集中至管底;

5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I (10U/ul)

6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;

7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

6.胶回收cDNA

1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶

2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。

3．电泳50V；1hr

4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。

5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）

6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII

7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮

8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）

9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬

10． 离心并去上清（同操作8）

11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清

12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清

13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。

15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。

注意事项：

1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

2．胶回收时电压要稳定。

第一链

第一链的合成

oligo(dT)引导的DNA合成法:

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.

缺 陷:

因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.

随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :

根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.

第二链

第二链的合成

第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。

自身引导

变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.

缺 点:

在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.

自身引导法合成双链cDNA

置换合成

原 理:

以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.

优点:a)合成cDNA的效率高

b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化

c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA

3,引物-衔接头法

cdna_cDNA文库 -克隆

将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖.

1,同聚物加尾法

利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个片段连接成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞.

同聚物加尾法克隆双链cDNA

2,接头-衔接头法

3,mRNA-cDNA克隆法

方 法:

在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.

缺 点:

克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10)

4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA

cdna_cDNA文库 -载体制备

1．pBlueScriptII的提取

1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。

2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。

3．第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6 hr左右，使OD值达到0.6-0.8。

4．将菌液移入250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平）

5．加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至终浓度100µg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。

6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置3-5min。

注： 静置时间勿超过5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。

8．4℃，5000rpm，离心15min。

9．取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。

10．每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。

11. 20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。

12．弃上清，用70%的乙醇洗2次。

13．弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。

14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf离心管中。

15．电泳检查DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。）

2．pBlueScriptII的双酶切消化

1．以如下体系进行EcoRI酶切：

pBSK(+) X µl（6µg）

ddH2O 174-X µl

10×Buffer E 20 µl

混匀，加入限制性内切酶：

EcoRI （10U/ µl） 6 µl

总体积为200 µl。

2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3．37℃，水浴1hr。

4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。

5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

6．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

7. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

8．加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

9．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。

11．加入以下试剂进行XhoI酶切：

ddH2O 74 µl

10×Buffer D 20 µl

混匀，加入限制性内切酶XhoI：

XhoI （10U/ µl） 6 µl

总体积为200 µl。

12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下

13.37℃，水浴1.5hr。

14．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。

15．4℃，13000rpm，离心15min。

16．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

17．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。

18. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

19．加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

20．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

21．自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。

3．载体去磷酸化

1．在40ul双酶切载体中加入以下试剂：

6ul 10×buffer

6ul CIAP（0.01U/ul）

8ul ddH2O

总体积60ul。

2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3.37℃，水浴1hr。

4．70℃，15min，灭活酶。

5．电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。

4．载体效率检测

1．按以下所示作4个连接反应：

14℃连接过夜。

2． 各取1ul连接产物作电转化（具体流程见电转化）

3．计算克隆数，计算载体相对脱磷效率及连接效率。

cdna_cDNA文库 -鸟枪法

又叫霰弹法,其特点是绕过直接分离基因这一关.由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上靠"运气".

原 理:

基因组DNA

物理(剪切力,超声波等) 或生化方法(限制性内切酶)切割

长度与一般基因大小相当的DNA片段的混合物

随机地重组入适当的载体

转 化

大肠杆菌中扩增

适当的方法筛选

要求有简便的筛选方法:

利用特定基因缺陷型(如营养缺陷型等)的受体细胞,或特定的寡核苷酸DNA 片段探针以特定基因产物的抗体,可通过双表型的筛选或用分子杂交技术,免疫筛选技术检出目的基因.

示例:面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取

EcoRI 载体

酵母DNA 片段基因 重组DNA

转化

"吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型"大肠杆菌

基本培养基

筛选,分离菌株

目的基因

cdna_cDNA文库 -物化方法

基因工程初始阶段所用的方法,已不用.利用核酸双螺旋之间存在着碱基G C,A T配对特性,分离目的基因.

例如:海胆rDNA分子内其G C含量可以达63%(其稳定性高,溶解温度高),通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA,最后经氯化铯平衡梯度离心,得到相对分子量为1.9X107Dal的高纯rDNA.

从基因文库中分离目的基因

cdna_cDNA文库 -分离基因

如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质,可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白的基因.

基本原理:

核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体,而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸;

将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温,形成多聚核糖体同抗体的复合体;

当加入特定蛋白的抗体产生的第二抗体时,产生沉淀,就可以通过不连续蔗糖梯度离心,将所要的含有特定的mRNA的多聚核糖体同总多聚核糖体分离;再通过酚,氯仿抽提去除蛋白及oligo-dT柱亲合层析,就可以得到为特定蛋白编码的mRNA,再通过反转录得到cDNA.

cdna_cDNA文库 -化学合成

基因的化学合成

基因片段的全化学合成

首先合成一个基因的所有片段,相邻的片段间有4―6个碱基的重叠互补,退火后,用T4DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因.

基因的化学―酶促合成

不需要合成完整基因的所有寡核苷酸片段,而是合成其中一些片段,相邻的3'-末端有一短的顺序相互补,在适当的条件下通过退火形成模板―引物复合体,然后在存在四种的条件下,用大肠杆菌DNA聚合酶I大片段填补互补片段之间的缺口,最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶.

cdna_cDNA文库 -PCR

PCR技术的应用

目的基因的直接克隆

与常规的基因克隆方法相比,PCR的优点是快速,简单,但是用PCR克隆目的基因的限制是必须知道侧接靶序列的核苷酸序列,以制备引物.因而该法具有很大的局限性.

可直接利用具有平端的PCR产物进行克隆,但利用合适的引物,在待克隆的目的基因二侧引入不同的限制性酶切点,则可将扩增之后的目的基因定向克隆到载体中,避免载体的自身环化,提高克隆效率.

cDNA的克隆

利用PCR技术,只需增加一步逆转录反应,便可从少数mRNA的构建cDNA文库,以mRNA为模板,以oligo(dT)为引物,在依赖于RNA 的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后,可通过PCR扩增此链.

如在此链的3'端再加上一段鸟苷酸残基同聚物,则可以使用oligo(dT)和oligo(dC)作为后续PCR扩增的引物,也可酌情在这些引物的5'端加上限制性酶切点,以利于将所得的双链DNA克隆到适当的载体中.

在某些情况下,如已知RNA(或其基因)两端的核苷酸序列,mRNA5'端核苷酸序列或其编码的蛋白质N端的氨基酸序列,便可设计特定的两端引物,用于直接克隆特定的目的基因cDNA,从而省略从cDNA文库中筛选cDNA克隆等序列费时的操作.

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