爱华网高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）又叫做高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱或近代柱色谱,以液体为流动相，采用高压输液系统，是色谱法的一个重要分支。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）又叫做高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱或近代柱色谱,以液体为流动相，采用高压输液系统，是色谱法的一个重要分支。
岛津10A液相色谱仪
它是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。这种方法已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术，是分析化学、生物化学和环境化学工作者手中必不可少的工具。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -发展简史
1906年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱”（Chromotography）、“色谱图”（Chromatogram）和“色谱法”（Chromatographic method）的概念。他在论文中写到：一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样，称之为色谱图。
经典液相色谱法
30年代以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。
1952年英国学者Martin和Synge 基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气－液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后的十多年间发展十分迅速的原因。
1958年基于Moore和Stein的工作，离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但分离效率尚不理想。
60年代中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。
70年代中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。
90年代以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因级计划，蛋白质组学有HPLC作预分离等。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -主要类型
1．吸附色谱(AbsorptionChromatography)2．分配色谱(PartitionChromatography)
3．离子色谱(IonChromatography)
4．体积排阻色谱(SizeExclusionChromatography)
5．亲和色谱(AffinityChromatography)
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -特点
高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：
〈1〉高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
〈2〉高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
〈3〉高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。
〈4〉应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
〈5〉分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5min内即可完成，一般小于1h。
此外HPLC还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。HPLC的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。HPLC检测器的灵敏度不及气相色谱。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -基本概念和术语
色谱图(chromatogram)――样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。基线(baseline)――经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
噪音(noise)――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)――基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)――组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：
前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。
峰底―基线上峰的起点至终点的距离。
峰高(peakheight，h)―峰的最高点至峰底的距离。
峰宽（peakwidth，W)―峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ
半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)―峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ
峰面积(peakarea，A)―峰与峰底所包围的面积。
保留时间(retentiontime，tR)――从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)――用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
分离度(resolution，R)――相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。
《中国药典》规定R应大于1.5。
拖尾因子(tailingfactor，T)――T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -流程与仪器
HPLC流程示意图
运行过程：如左图所示，溶剂贮器（1）中的流动相被泵（2）吸入，经〔3〕梯度控制器按一写的梯度进行混后然后输出，经（4）测其压力和流量，导入（5进样阀（器）经（6）保护柱、（7）分离柱后到（8）检测器检测，由（10）数据处理设备处理数据或（11）记录仪记录色谱图，（12）馏分收集器收集馏分，（13）为废液。
色谱柱
高效液相色谱仪可分为以下几个部分：
1. 高压输液泵：
（1）功能：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统；
（2）性能要求：流量稳定（±1?），耐高压（30－60Mpa），耐各种流动相：例如：有机溶剂、水和缓冲液；
（3）种类：往复泵和隔膜泵。
2. 色谱柱
（1）功能：分离样品中的各个物质；
（2）尺寸：10～30cm长，2～5mm内经的内壁抛光的不锈钢管柱；
（3）填料粒度：5～10μm，高效微粒固定相；
3. 进样器
（1）功能：将待分析样品引入色谱系统；
（2）种类：①注射器，10Mpa以下，1～10μl微量注射器进样；②停流进样；③阀进样，常用、较理想、体积可变，可固定；④自动进样器，有利于重复操作，实现自动化。
4. 检测器
（1）功能：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号；
（2）分类：
①示差折光化学检测器
②紫外吸收检测器
进样器
③紫外一可同分光光度检测器
④二极管阵列紫外检测器
⑤荧光检测器
⑥电化学检测器
5. 馏分收集器
（1）功能：如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做其它波谱鉴定，或获取少量试验样品的小型制备，馏分收集是必要的；
（2）方法：①手工，少数几个馏分，手续麻烦，易出差错。②馏分收集器收集，比较理想，微机控制操作准确。
6. 数据获取和处理系统
功能：把检测器检测到的信号显示出来。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -分类
根据分离原理的不同，可分为：
（一）液－液色谱法（或称液－液分配色谱法）
流动相和固定相都是液体。试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。跟气一液分配色谱有相似之处：分离顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大。分配系数为溶质在固定相和流动相中的浓度之比。但是气相色谱法中流动相的性质对分配系数影响大小，而液相色谱中流动相的种类对分配系数却有较大的影响。
（二）液一固色谱法（或称吸附色谱法）
流动相为液体，固定相为吸附剂。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。溶质分子被固定相吸附，将取代固定相表面上的溶剂分子。如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应地减少。吸附性大的溶质就会最后流出。
液一固色谱适用于分离相对分子质量中等的油溶性样品，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。凡能用薄层色谱成功地进行分离的化合物，亦可用液一固色谱进行分离。缺点是由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。
（三）离子交换色谱法
离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的一种方法。
离子交换色谱主要用来分离离子或可离解的化合物，它不仅用于无机离子的分离，例如稀土化合物及各种裂变产物，还用于有机物的分离。20世纪60年代前后，已成功地分离了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化学领域得到了广泛的应用。
〔四）离子对色谱法
离子对色谱法是将一种（或多种）与溶剂分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。
离子对色谱，特别是反相离子对色谱解决了以往难分离混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子和非离子的混合物，特别对一些生化样品如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱以及药物等的分离。另外还可以借助离子对的生成给样品引入紫外吸收或发荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
（五）离子色谱法
离子色谱是目前唯一能获得快速、灵敏、准确和多组分分析效果的方法，因而受广泛重视并得到迅速的发展。检测手段已扩展到电导检测器之外的其它类型的检测器，如电化学检测器，紫外光度检测器等。可分析的离子正在增多，从无机和有机阴离子至金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用离子色谱法进行分析。
（六）空间排阻色谱
空间排阻色谱以凝胶为固定相，它的分离机理与其它色谱完全不同。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积或分子大小有关。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -应用实例
HPLC更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。左图示是其用于有机氯农药的测定：
高效液相色谱法
采用液一固色谱法，固定相：薄壳硅胶CorasilⅡ（37~50μm）；流动相：正己烷；色谱柱：50cm×2.5mm内径；流速：1.5ml/min；检测器：示差折光
1－艾氏剂；2－p，p’－DDT；3－p，p’－DDD；4－γ－666；5－恩氏剂。
高效液相色谱法_高效液相色谱法 -参考资料
《现代色谱分析》复旦大学出版社 ，张祥民著，2006
《高压液相色谱法》原子能出版社，金恒亮等，1987
